Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina
Summary
Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell’affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.
Abstract
Delucidazione delle proprietà dell’associazione di proteine della cromatina-targeting può essere molto impegnativa a causa della natura complessa della cromatina e la natura eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina. Per superare questi ostacoli, abbiamo adattato un’analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) per valutare le affinità relativa di legame dei complessi cromatina associato. Questo test semplice e può essere utilizzato da non esperti per valutare la differenza relativa affinità di due complessi correlati, i cambiamenti nell’affinità di un complesso quando una subunità viene persa o un singolo dominio è inattivato e il cambiamento in obbligatoria affinità di legame dopo alterazioni al paesaggio della cromatina. Sospendendo in sequenza nuovamente alla rinfusa della cromatina in quantità crescenti di sale, siamo in grado di profilare l’eluizione di una particolare proteina dalla cromatina. Utilizza questi profili, siamo in grado di determinare come le alterazioni in un complesso modificante la cromatina o alterazioni all’ambiente della cromatina influenzano interazione di legame. SSE di accoppiamento con altri saggi in vitro e in vivo , possiamo determinare i ruoli dei singoli domini e delle proteine sulla funzionalità di un complesso in una varietà di ambienti di cromatina.
Introduction
Regolamento del DNA in cellule eucariotiche è un sistema complesso e sofisticato che è strettamente controllato da un assortimento di proteine che coordinano le risposte agli stimoli intracellulari ed extracellulari. DNA è avvolto intorno octamers dell’istone di nucleosomi forma, che possono essere liberamente distribuiti lungo DNA o compattati in bobine stretto1. Questo arrangiamento strutturale del DNA e gli istoni è detta cromatina, che è regolata da una rete di proteine che leggere, scrivere e cancellare le modifiche post traduzionale (PTM) su istoni2. Alcune istone PTMs, quali acetilazione, cambiare la carica dell’amminoacido sono depositati, alterando le interazioni tra gli istoni e il DNA2. Istone PTMs servono anche a reclutare regolatori trascrizionali, remodelers della cromatina, apparato di riparazione di danni del DNA e replicazione del DNA a specifiche regioni del genoma3.
Maggior parte dei metodi per lo studio delle interazioni della cromatina o sonda interazioni su piccola scala o coinvolgere grandi analisi genoma. Studi di binding in vitro spesso utilizzano i singoli domini ricombinanti con istone peptidi o DNA in saggi quali analisi di spostamento di elettroforesi di mobilità (EMSA), calorimetria isotermica di titolazione, polarizzazione di fluorescenza e peptide trazioni alla lat machine. Perché queste analisi in genere concentrano su un dominio di singole proteine, essi facilitano la comprensione di un piccolo pezzo del puzzle, ma non ci permettono di capire la natura cooperativa di proteine multidominio, figuriamoci il loro ruolo in multi-proteina complessi. Dalla composizione eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina è aggiunto un ulteriore livello di complessità. Questa eterogeneità di proteina, in combinazione con la natura dinamica del paesaggio della cromatina, rende difficile per ricapitolare l’ in vivo collegamento interazioni di proteine cromatiniche a cromatina in vitro.
Metodi in vivo hanno fatto progressi significativi; Tuttavia, sono spesso costoso, richiede tempo e tecnicamente impegnativo. Immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento (ChIP-seq) è molto utile per determinare la localizzazione delle proteine e modificazioni istoniche in tutto il genoma, ma richiede notevole ottimizzazione4. Le proteine sono spesso reticolato di cromatina per preservare interazioni; Tuttavia, questo può produrre interazioni artificiale e potrebbe causare epitopo5di mascheramento. Inoltre, l’immunoprecipitazione (IP) richiedono anticorpi altamente specifici e vasta ottimizzazione di taglio del DNA e condizioni IP da ChIP-qPCR utilizzando un sito di legame noto, che spesso non è disponibile a priori. Dopo l’ottimizzazione delle condizioni di ChIP, elaborazione dei campioni è costosa e richiede parecchie settimane ai mesi di sequenza e analizzare. Anche se questo metodo ha un valore inestimabile per identificare la localizzazione della cromatina associata proteine in tutto il genoma, il costo e impegno di tempo rendono proibitivo per utilizzare questo metodo per generare le ipotesi su come piccole modifiche possono influenzare le proprietà di associazione globale .
In questo articolo, descriviamo come un’analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) può essere usata per esaminare i profili di associazione globale di cromatina-proteine e distinguere come cambi in un profilo proteico, complesso, o globale PTM possono alterare le interazioni. Anche se le estrazioni sale sono una tecnica comunemente e ampiamente utilizzata, dimostriamo come questo metodo sequenza è altamente riproducibile e versatile. SSE permette di caratterizzare come una singola subunità di un complesso o anche un singolo dominio contribuisce l’affinità complessiva del complesso per cromatina alla rinfusa. SSE può essere utilizzata anche per determinare se l’associazione di una proteina è influenzato dai cambiamenti nel paesaggio della cromatina, fornendo interessanti ipotesi per istone mark targeting che possono essere confermate mediante ChIP-seq e altri studi di ampia del genoma.
Abbiamo adattato originariamente questo metodo da Wu et al., per esaminare la funzione di Polybromo1 (PBRM1) nell’associazione del PBAF della cromatina remodeler6,7. Utilizzando questa tecnica, abbiamo determinato il ruolo di PBRM1 per l’associazione di cromatina all’interno del complesso di rimodellamento della cromatina PBAF e quindi determinato il contributo relativo della sei bromodomains singoli per questa funzione7.
Qui descriviamo come ottimizzare questo metodo per esplorare associazione della cromatina in diversi tipi cellulari, per valutare l’affinità obbligatoria relativa della cromatina simile modifica complessi, per esaminare lo spostamento di una proteina dalla cromatina da un inibitore chimico, e per determinare gli effetti dell’associazione di cromatina dopo alterazioni al paesaggio della cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caratterizzazione delle interazioni della proteina e della cromatina attraverso estrazioni sale è un metodo comune che è stato impiegato per decenni14,15; Tuttavia, esso non è stato sistematicamente ottimizzato prima di rivelare la sua utilità completo. Dimostriamo come questo metodo sequenza consente di distinguere le modifiche nell’associazione della cromatina quando la proteina o per l’ambiente è alterata in modo rapido e poco costoso. SSE è altamente ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un premio di studioso di V (V2014-004) e un erudito V plus award (D2016-030) dalla Fondazione V for Cancer Research e un American Cancer Society istituzionale Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) al centro di Università di Purdue per cancro Ricerca. E. g. P. è stato sostenuto dal Borch Graduate Endowment Award al reparto di farmacologia molecolare e chimica farmaceutica di Purdue University.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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