Sekventiell Salt extraktioner för analys av Bulk kromatin bindande egenskaper av kromatin ändra komplex
Summary
Sekventiell salt utvinning av kromatin bundna proteiner är ett användbart verktyg för att fastställa bindande egenskaper för stora proteinkomplex. Denna metod kan användas för att utvärdera enskilda subenheter eller domäner i den övergripande affinitet av ett proteinkomplex bulk kromatin roll.
Abstract
Förtydligandet av kromatin-targeting proteiners bindande egenskaper kan vara mycket utmanande på grund av den komplicerade karaktären av kromatin och mest däggdjur kromatin-ändra komplex heterogena karaktär. För att övervinna dessa hinder, har vi anpassat en sekventiell salt extraktion (SSE) analys för att utvärdera de relativa bindande tillhörighet av kromatin-bundet komplex. Denna enkelt och okomplicerat analys kan användas av icke-experter för att utvärdera den relativa skillnaden i bindande affinitet av två relaterade komplex, förändringar i affinitet av ett komplex när en subenhet går förlorad eller en enskild domän är inaktiverat och förändringen i bindningsaffinitet efter ändringar av kromatin landskapet. Genom att sekventiellt åter avbryta bulk kromatin i ökande mängder av salt, har vi möjlighet att profilera elueringen av ett visst protein från kromatin. Med hjälp av dessa profiler, har vi möjlighet att avgöra hur förändringar i ett kromatin-ändra komplex eller förändringar kromatin miljön påverka bindande interaktioner. Koppling SSE med andra in vitro och in-vivo -analyser, kan vi bestämma enskilda domäner och proteiner på funktionaliteten i ett komplex i en mängd olika kromatin miljöer roller.
Introduction
DNA förordning i eukaryota celler är en invecklad och sofistikerade system som styrs hårt av ett sortiment av proteiner som samordna Svaren till intracellulär och extracellulär stimuli. DNA är virad runt Histon octamers att bilda nucleosomes, som kan vara löst fördelade längs DNA eller packas in i snäva spolar1. Detta strukturella arrangemang av DNA och histoner som kallas kromatin, som regleras av ett nätverk av proteiner som läsa, skriva och radera inlägget translationella modifieringar (PTM) på histoner2. Vissa Histon PTMs, såsom acetylering, ändra avgiften av den amino syran de sätts på, att förändra samspelet mellan histoner och DNA2. Histon PTMs också fungera att rekrytera transkriptionell regulatorer, kromatin remodelers, DNA skador reparation maskiner och DNA-replikering maskiner till specifika regioner i genomet3.
De flesta metoder för att studera kromatin interaktioner antingen sond småskaliga interaktioner eller involvera stora genome-wide analyser. In vitro studier utnyttjar ofta enskilda rekombinant domäner med Histon peptider eller DNA analyser som elektrofores rörlighet Skift analyser (EMSA), isotermiska titrering calorimetry, fluorescence polarization och peptid pulldowns. Eftersom dessa analyser fokuserar oftast på en enskild protein domän, de underlätta förståelsen av en liten pusselbit, men tillåter inte oss att förstå den kooperativa typ av multi-domän proteiner, för att inte tala om deras roll i flera protein komplex. Ytterligare ett lager av krångliga läggs av den heterogena sammansättningen av mest däggdjur kromatin-ändra komplex. Detta protein heterogenitet, gör i kombination med den dynamiska karaktären av kromatin landskapet, det utmanande för att sammanfatta den i vivo bindande interaktioner av kromatin proteiner till kromatin in vitro.
In vivo -metoder har gjort betydande framsteg; men är de ofta dyrt, tidskrävande och tekniskt utmanande. Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-seq) är mycket användbart för att bestämma localizationen av proteiner och Histon ändringar hela genomet, men det kräver betydande optimering4. Proteiner är ofta tvärbundna till kromatin att bevara interaktioner; men detta kan producera konstgjorda interaktioner och kan orsaka epitop maskering5. Dessutom kräver immunoprecipitations (IP) mycket specifika antikroppar och omfattande optimering av DNA klippning och IP tillstånd av ChIP-qPCR med hjälp av en känd bindningsställe, vilket ofta inte tillgängliga förhand. Efter optimering av ChIP villkor, bearbetning av proverna är kostsamma och kräver flera veckor till månader för att sekvensera och analysera. Även denna metod är ovärderlig för att identifiera lokaliseringen av kromatin bundna proteiner hela genomet, kostnaden och tid engagemang gör det oöverkomliga att använda denna metod för att generera hypoteser om hur små förändringar kan påverka globala bindande boenden .
I den här artikeln beskriver vi hur en sekventiell salt extraktion (SSE) analysen kan användas för att undersöka globalt bindande profiler av kromatin-bundna proteiner och särskilja hur förändringar i en protein, komplexa eller global PTM profil kan ändra interaktioner. Även salt extraktioner är ett vanligt och allmänt använd teknik, visar vi hur denna sekventiell metod är mycket reproducerbara och mångsidig. SSE tillåter oss att karakterisera hur en enda del av ett komplex eller ens en enda domän bidrar till anläggningens totala affinitet för bulk kromatin. SSE kan också användas för att avgöra om bindningen av ett protein påverkas av förändringar i kromatin landskap, som ger intressanta hypoteser för Histon mark inriktning som kan bekräftas med hjälp av ChIP-seq och andra genome bred studier.
Vi ursprungligen anpassat denna metod från Wu et al., pröva funktionen av Polybromo1 (PBRM1) i bindningen av PBAF kromatin remodeler6,7. Med denna teknik, vi bestäms rollen av PBRM1 för kromatin bindande inom PBAF kromatinet remodeling complex och sedan bestäms de sex enskilda bromodomains till denna funktion7relativa bidrag.
Här beskriver vi hur man kan optimera denna metod för att utforska kromatin bindande i olika celltyper, att bedöma det relativa affinitet av liknande kromatin ändra komplex, för att undersöka förskjutningen av ett protein från kromatin genom en kemiska hämmare, och att fastställa effekterna av kromatin bindande efter ändringar av kromatin landskapet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karaktärisering av protein och kromatin interaktioner genom salt extraktioner är en vanlig metod som har använts för årtionden14,15. men har det inte systematiskt optimerats innan för att avslöja dess full nytta. Vi visar hur sekventiella metoden ger en snabb och billig sätt att urskilja förändringar i kromatin bindande när proteinet eller miljön förändras. SSE är mycket anpassningsbar och optimerbart, och ännu viktigare, det är tekniskt enkel oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en V scholar award (V2014-004) och en V scholar plus award (D2016-030) från V Stiftelsen för cancerforskning och en amerikansk institutionella forskningsbidrag för Cancer Society (ACS IRG Grant 58-006-53) till Purdue University Center för Cancer Forskning. E. G. P. stöddes av Borch Graduate Endowment tilldelning till Purdue University läkemedelskemi och Molekylär farmakologi institutionen.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
