Sekvensiell Salt utdrag for analyse av Bulk Chromatin bindende egenskaper Chromatin endre komplekser
Summary
Sekvensiell salt avstamning av chromatin bundet proteiner er et nyttig verktøy for å bestemme Bindingsegenskapene for store protein komplekser. Denne metoden kan brukes til å vurdere rollen personlige underenheter eller domener i det samlede affinitet til et protein kompleks til bulk chromatin.
Abstract
Utviklingen av Bindingsegenskapene for chromatin målretting proteiner kan være svært utfordrende på grunn av den komplekse naturen chromatin og heterogene natur mest pattedyr chromatin-modifisere komplekser. For å overvinne disse hindringene, har vi tilpasset en sekvensiell salt avstamning (SSE) analysen for å evaluere de relative bindende slektskap av chromatin-bundet komplekser. Denne enkel og grei analysen kan brukes av ikke-eksperter for å evaluere den relative forskjellen i bindingen affinitet to relaterte komplekser, endringene i affinitet av et kompleks når en er tapt eller en individuell domenenavn er inaktiv og endring i forpliktende tilhørighet etter endringer i det chromatin landskapet. Ved sekvensielt re suspendere bulk chromatin i økende mengder salt, er vi kunne profil tilsettes et bestemt protein fra chromatin. Bruke disse profilene, er vi kunne fastslå hvordan endringer i en chromatin-modifisere kompleks eller endringer chromatin miljøet påvirke bindingen interaksjoner. Kopling SSE med andre i vitro og i vivo analyser, kan vi finne ut rollene enkeltdomener og proteiner funksjonalitet av et kompleks i en rekke chromatin miljøer.
Introduction
DNA regulering i eukaryote celler er en intrikat og sofistikert som er strengt kontrollert av et utvalg av proteiner som koordinere reaksjonene til intracellulær og ekstracellulære stimuli. DNA er pakket rundt histone octamers til form nucleosomes, som kan bli løst fordelt langs DNA eller komprimeres i tett spoler1. Dette strukturelle arrangement av DNA og histones kalles chromatin, som er regulert av et nettverk av proteiner som lese, skrive og slette innlegget translasjonsforskning endringer (PTM) på histones2. Noen histone PTMs, som acetylation, endre ansvaret for aminosyren de settes på, endre interaksjoner mellom histones og DNA2. Histone PTMs også tjene til å rekruttere transcriptional regulatorer, chromatin remodelers, DNA skade reparasjon maskiner og DNA replikering maskiner til bestemte områder i genomet3.
De fleste metoder for å studere chromatin vekselsvirkningene enten sonde småskala interaksjoner eller involverer store genomet hele analyser. In vitro bindende studier utnytte ofte personlige rekombinant domener med histone peptider eller DNA i analyser som geleelektroforese mobilitet Skift analyser (EMSA), isotermiske titrering calorimetry, fluorescens polarisering og peptid pulldowns. Fordi disse analyser vanligvis fokusere på et enkelt protein domene, de lette forståelsen av en liten bit av puslespillet, men tillater ikke oss å forstå samarbeidsvillig natur multi-domene proteiner, enn si sin rolle i flere protein komplekser. Et lag av intrikate legges av heterogene sammensetningen av mest pattedyr chromatin-modifisere komplekser. Denne protein heterogenitet, gjør sammen med dynamikken i chromatin landskapet, det utfordrende for å recapitulate den i vivo binding interaksjoner chromatin proteiner til chromatin i vitro.
I vivo metoder har gjort betydelige fremskritt; men er de ofte dyre, tidkrevende og teknisk utfordrende. Chromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) er svært nyttig for å bestemme lokaliseringen av proteiner og histone endringer over genomet, men det krever betydelig optimalisering4. Proteiner er ofte krysskoblet til chromatin å bevare samhandling; men dette kan produsere kunstig interaksjoner og kan forårsake epitope maskering5. Videre krever immunoprecipitations (IP) svært spesifikke antistoffer og omfattende optimalisering av DNA klipping IP av ChIP-qPCR bruker en kjent binding området, som ofte ikke er tilgjengelig en priori. Etter optimalisering av ChIP, behandling av prøvene er kostbare og krever flere uker til måneder sekvens og analysere. Selv om denne metoden er uvurderlig for å identifisere lokaliseringen av chromatin bundet proteiner over genomet, kostnader og tidsbruk gjør det uoverkommelige bruke denne metoden til å generere hypoteser om hvordan små endringer kan påvirke global bindingsegenskapene .
I dette papir beskriver vi hvordan en sekvensiell salt avstamning (SSE) analysen kan brukes til å undersøke globale bindende profiler av chromatin-bundet proteiner og skille hvordan endringer i en protein, komplekse eller global PTM profil kan endre interaksjoner. Salt utdrag er en vanlig og bredt brukt teknikk, viser vi hvordan denne sekvensielle metoden er reproduserbare og svært allsidig. SSE tillater oss å karakterisere hvordan en enkelt undergruppe til en kompleks eller en enkelt domene bidrar til kompleksets samlede affinitet for bulk chromatin. SSE kan også brukes til å avgjøre hvis binding av et protein er påvirket av endringer i chromatin landskap, gir interessante hypoteser for histone merke målretting som kan bekreftes ved hjelp av ChIP-seq og andre genomet bredt studier.
Vi tilpasset denne metoden fra Wu et al., undersøke av den Polybromo1 (PBRM1) i bindingen av PBAF chromatin remodeler6,7. Bruker denne teknikken, vi bestemt rollen som PBRM1 for chromatin-tilknytning i PBAF chromatin remodeling komplekse og da fastsatte relative andel av de seks individuelle bromodomains til denne funksjonen7.
Her beskriver vi hvordan å optimalisere denne metoden for å utforske chromatin binding i ulike celletyper, å vurdere relativ forpliktende tilhørighet av lignende chromatin å endre komplekser, for å undersøke forskyvning av et protein fra chromatin av en kjemisk inhibitor, og å bestemme effekten av chromatin binding etter endringer i det chromatin landskapet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karakteristikk av protein og chromatin vekselsvirkningene gjennom salt utdrag er en felles metode som har vært ansatt for tiår14,15; men har det ikke blitt systematisk optimalisert før for å avsløre sin full nytte. Viser vi hvordan denne sekvensielle metoden gir en rask og rimelig måte å skille endringer i chromatin binding når protein eller miljøet endres. SSE er svært tilpasningsdyktige og optimerbare, og viktigst, er teknisk enkelt og krever ingen sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en V scholar award (V2014-004) og en V scholar pluss award (D2016-030) fra V grunnlaget for kreftforskning og en American Cancer Society institusjonelle forskningsstipend (ACS IRG Grant 58-006-53) på Purdue University Center for Cancer Forskning. E. G. P. ble støttet av Borch Graduate legat prisen til Purdue University medisinsk kjemi og Institutt for molekylær farmakologi.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
