電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟
Summary
心臓biowireプラットフォームは、電気刺激と三次元細胞培養を組み合わせることによって、ヒト胚および誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CM）を成熟するために使用されるインビトロの方法です。この原稿は、心臓biowireプラットフォームの詳細な設定を提示します。
Abstract
ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CMS）は、有望な細胞源となっているため、創薬、疾患のモデリング、組織工学、再生医療を含む心臓研究におけるそれらの潜在的なアプリケーションの調査を奨励しています。しかし、既存のプロトコルにより生成される細胞は、天然成体心室心筋細胞と比較して未成熟の範囲を表示します。多くの努力がこれまで達成のみ中等度の成熟に、HPSC-CMSを成熟する試みがなされてきました。したがって、biowire呼ば操作システムは、in vitroでのより成熟した状態にHPSC-CMSをリードする物理的および電気的の両方の手がかりを提供することによって考案されています。システムは、私が徐々に増加する周波数と電場刺激にさらされる整列心臓組織（biowire）にアセンブルする剛性テンプレート縫合糸に沿ってゲル型コラーゲンにHPSC-CMSを播種するために微細加工プラットフォームを使用します。非刺激対照と比較して、biowired心筋細胞は、構造的および電気生理学的成熟の強化度を示す刺激しました。このような変化は、刺激速度に依存します。本稿では詳細にbiowiresの設計と作成について説明します。
Introduction
セルベースの治療が最も有望なの一つであり、心臓修復/再生を実現するための戦略を検討しました。これは、心臓組織工学と生体材料1、2の共同送達によって助けられています。ほとんどの利用可能な細胞源は、損傷、病気の、または高齢者の心3上の彼らの潜在的に有益な効果のための動物モデルで研究されています。具体的には、多大な努力は、ヒト多能性幹細胞を使用する試みがなされている（HPSC）は、心筋（HPSC-CM）、心臓組織工学のための潜在的に無制限の自己細胞源由来しました。 HPSC-CMSは、いくつかの確立されたプロトコル4、 図5、 図6を用いて製造することができます。しかし、得られた細胞は、成体心室心筋7に比べ未熟特性の範囲は、胎児様表現型を表示します</sup> 8。これは、創薬研究における成人の心臓疾患モデル9の開発における成人の心臓組織のモデルとしてHPSC-CMのアプリケーションに障害となり得ます。
表現型の未熟さのこの制限を克服するためには、新しいアプローチが積極的に心筋細胞の成熟を促進するために研究されてきました。初期の研究は、環状機械10又は電気的刺激11を介して新生児ラット心筋細胞における効果的なプロ成熟特性を明らかにしました。ゲルの圧縮および環状機械的刺激はまた、電気生理学およびカルシウムハンドリング性の最小の増強とのhpSC-CMの成熟12、13、のいくつかの側面を改善することが示されました。したがって、「生物学的ワイヤ」（biowire）と呼ばれるプラットフォームシステムは、構造的な手がかりと電界の両方を提供することによって考案されたstimulatioHPSC-CMS 14の成熟を強化するためのn。このシステムは、電場刺激を受けやすい整列心臓組織を作成するための微細加工プラットフォームを使用しています。これはHPSC-CMの構造的および電気生理学的成熟度を向上させるために使用することができます。ここで、我々は、このようなbiowiresを作るの詳細を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿はHPSC-CMの成熟を改善するために、設計プラットフォーム、biowireのセットアップと実装について説明します。デバイスは、標準的な微細加工設備で行うことができ、そしてbiowiresは、共通の細胞培養技術及び電気刺激を用いて製造することができます。
我々の知る限りでは、biowiresに似一切報告されている方法はありません。この戦略は、より高い刺激レートの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、費補助金のハートからでサポートされているとされたストロークカナダ（G-14から0006265）の財団、ヘルスリサーチ（137352と143066）、およびJP Bickell財団助成金のカナダの研究所からの運営費交付金（1013821 ）SSNへ。
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
