Modning av human-stamcelle avledet kardiomyocytter i Biowires ved hjelp av elektrisk stimulering

Summary

Hjerte biowire plattformen er en in vitro metode som brukes til å modne humane embryonale og induserte pluripotent stamcelle-avledet kardiomyocytter (hPSC-CM) ved å kombinere tredimensjonale celledyrking med elektrisk stimulering. Dette manuskriptet presenterer detaljert oppsett av hjerte biowire plattformen.

Abstract

Humane pluripotente stamceller celleavledede kardiomyocytter (hPSC-CMS) har vært en lovende celle kilde, og har således oppmuntret til undersøkelse av deres potensielle anvendelser i hjerteundersøkelser, inkludert medisiner, sykdom modellering, regenerering av vev, og regenerativ medisin. Imidlertid celler som produseres av eksisterende protokoller viser et utvalg av umodenhet sammenlignet med native voksen ventrikulære kardiomyocytter. Mange forsøk har vært gjort for å modne hPSC-CMS, med bare moderat modning oppnådd så langt. Derfor, en konstruert system, kalt biowire, har blitt utviklet ved å gi både fysiske og elektriske signaler for å lede hPSC-CMs til en mer moden tilstand in vitro. Systemet benytter en mikrofabrikert plattform for å pode hPSC-CMs i kollagen type I gelere sammen en stiv mal sutur for å montere inn på linje hjertevev (biowire), som utsettes for elektrisk feltstimulering med en progressivt økende frekvens. Sammenlignet med stimulerte kontroller,stimulert biowired kardiomyocytter oppviser en forbedret grad av strukturell og elektrofysiologisk modning. Slike forandringer er avhengig av stimulering hastighet. Dette manuskriptet beskriver i detalj design og etablering av biowires.

Introduction

Cellbasert terapi er en av de mest lovende og undersøkte strategier for å oppnå hjertereparasjon / regenerering. Det har blitt hjulpet av hjertevevsteknikk og samlevering av biomaterialer ^{1 , 2} . De fleste tilgjengelige cellekilder har blitt studert i dyremodeller for deres potensielt gunstige effekter på skadede, syke eller eldre hjerter ³ . Spesielt er det gjort betydelige anstrengelser for å bruke hPSC-avledede kardiomyocytter (hPSC-CM), en potensielt ubegrenset autolog cellekilde for hjertevevsteknikk. HPSC-CM kan produseres ved hjelp av flere etablerte protokoller ^{4 , 5 , 6} . Imidlertid viser de oppnådde cellene føtalignende fenotyper, med et område av umodne egenskaper sammenlignet med voksne ventrikulære kardiomyocytter ^{7 ,} </sup> ^8. Dette kan være et hinder for anvendelsen av hPSC-CMS som modeller for voksne hjertevevet i legemiddelforskning forskning og i utviklingen av voksne hjertesykdomsmodeller ^9.

For å overvinne denne begrensningen av fenotypiske umodenhet, har nye tilnærminger vært aktivt undersøkt for å fremme cardiomyocyte modning. Tidlige studier viste effektive pro-modnings egenskaper i neonatalt rotte-kardiomyocytter via cyklisk mekanisk ¹⁰ eller elektrisk stimulering ^11. Gel komprimering og cyklisk mekanisk stimulering, ble også vist seg å forbedre noen aspekter av hPSC-CM modning ^{12, 13,} med minimal forbedring av de elektrofysiologiske og kalsiumhåndteringsegenskaper. Derfor, et plattformsystem som kalles "biologisk wire" (biowire) ble utviklet ved å tilveiebringe både strukturell signaler og elektrisk felt stimulation for å øke modningen av hPSC-CMs ^14. Dette systemet bruker et mikrofabrikert plattform for å skape innrettet hjertevevet som er mottakelig for elektrisk feltstimulering. Dette kan brukes til å forbedre den strukturelle og elektrofysiologisk modenhet av hPSC-CMs. Her beskriver vi detaljene gjøre slike biowires.

Protocol

1. Master Design og Fabrication MERK: Bruk myk litografi for enhetens fabrikasjon. Lag en tolags SU-8 master for polydimetylsiloksan (PDMS) støping. Design enheten ved hjelp av en design og utkast programvare ( Figur 1A , venstre). Tegn hvert lag av masteren separat. Skriv ut enhetens design på to fotomasker ved 20.000 dpi, tilsvarende de to lagene i master 15 . Sett enhetsmønsteret så gjennomsiktig og omgivelsene er like mørke; Masker…

Representative Results

Den rasjonelle for bruk av en sutur i biowires er å tjene som et templat for dannelsen av 3D-konstrukter som tilpasses i en akse og som etterligner formen av hjerte fibre. Vi viser at etter syv dagers dyrking i biowire, celler ombygd gelen rundt suturen (figur 3A). Cellene montert langs aksen av suturen for å danne innrettet kardialt vev (figur 3). Etter 7 dager forkultur ble biowires kastet 7 dager etter elektrisk feltstimulering og videre oppviste eg…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver oppsett og gjennomføring av konstruert plattform, biowire, for å forbedre modning av hPSC-CMS. Anordningen kan fremstilles i standard microfabrication anlegg, og biowires kan fremstilles med vanlige celledyrkningsteknikker og en elektrisk stimulator.

Så vidt vi vet, er det ingen rapporterte metode lik biowires. Denne strategien viser at forbedrede modnings egenskaper var avhengig av den elektriske stimulering regime, som vist ved den større modningsnivå man …

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin