تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)
Summary
جنبا إلى جنب السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT) هو استراتيجية البروتينات الكمية التي تعزز القدرات المتنوعة عينة من علامات إسوي الضغط. يصف هذا البروتوكول تطبيق cPILOT إلى الأنسجة من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر.
Abstract
وهناك طلب متزايد على تحليل العديد من العينات البيولوجية لفهم المرض واكتشاف العلامات البيولوجية. استراتيجيات البروتينات الكمية التي تسمح بقياس وقت واحد من عينات متعددة أصبحت على نطاق واسع والحد بشكل كبير من تكاليف التجريبية والأوقات. وضعت لدينا مختبر تقنية تسمى مجتمعة السلائف وضع العلامات النظائر ووضع علامات إسوي الضغط (cPILOT)، مما يعزز عينة مضاعفة لوضع العلامات النظائر التقليدية أو النهج علامات إسوي الضغط. cPILOT العالمية يمكن تطبيقها على عينات القادمة من الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها ويعطي معلومات عن وفرة البروتين النسبية في الظروف عينة مختلفة. cPILOT يعمل عن طريق 1) باستخدام الظروف عازلة انخفاض الرقم الهيدروجيني بشكل انتقائي الببتيد dimethylate N-ترميني و 2) باستخدام الظروف عازلة عالية الحموضة لتسمية الأمينات الأولية من بقايا يسين مع الكواشف إسوي الضغط المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف). درجة العينة مضاعفة المتاح هو يعتمد على عدد من التسميات السلائف المستخدمة وكاشف علامات إسوي الضغط. هنا، نقدم تحليل 12 نوع plex باستخدام الضوء وdimethylation الثقيلة جنبا إلى جنب مع الكواشف إسوي الضغط ستة نوع plex لتحليل 12 عينة من الأنسجة الماوس في تحليل واحد. تعزيز مضاعفة مفيد لتقليل الوقت والتكلفة التجريبية والأهم من ذلك، مما يسمح المقارنة بين العديد من الظروف العينة (مكررات البيولوجية، ومرحلة المرض، والعلاج بالعقاقير، المورثات، أو طولية نقاط الوقت) مع ميل أقل التجريبية والخطأ. في هذا العمل، ويستخدم النهج cPILOT العالمي لتحليل الدماغ والقلب والكبد والأنسجة عبر مكررات البيولوجية من نموذج الفأر المرض والبرية من نوع ضوابط مرض الزهايمر. يمكن تطبيقها العالمية cPILOT لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى وتكييفها لزيادة عينة المتنوعة إلى أكثر من 20 عينة.
Introduction
البروتينات غالبا ما ينطوي على تحليل العديد من العينات المستخدمة لفهم أفضل لعمليات المرض، حركية الانزيم، التعديلات بعد متعدية، والاستجابة للمؤثرات البيئية والاستجابة للعلاجات العلاجية، واكتشاف العلامات البيولوجية، أو آليات المخدرات. يمكن استخدام الأساليب الكمية لقياس الفروق النسبية في مستويات البروتين في عينات ويمكن أن تكون خالية من التسمية أو تنطوي على وضع العلامات النظائر (التمثيل الغذائي أو الكيميائية أو الأنزيمية). نمت أساليب النظائر المستقرة العلامات شعبية لأنها تسمح للكثير من عينات لتحليلها في وقت واحد ومناسبة لعينات من خلايا مختلفة، والأنسجة وسوائل الجسم، أو الكائنات الحية كلها. النظائر الوسم طرق 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 زيادة الإنتاجية التجريبية،مع الحد من اكتساب الوقت والتكاليف والخطأ التجريبي. هذه الأساليب تستخدم أطياف الشامل تمهيدا لقياس فرة نسبية من البروتينات من القمم الببتيد. في المقابل، الكواشف علامات إسوي الضغط 8، 9، 10 توليد أيونات مراسل التي إما أن تكون في الكشف عن MS / MS أو MS 3 11 الأطياف وتستخدم هذه القمم أن يقدم تقريرا عن فرة نسبية من البروتينات.
للدولة من بين الفن الحالي في مضاعفة البروتينات إما أن يكون 10 نوع plex 12 أو 12 نوع plex إسوي الضغط العلامة تحليل 13. تعزيز مضاعفة العينة (أي> 10 عينة) تم وضعها من قبل وسائل مختبرنا لأنسجة 14 و 15 و 16 و 17، وآخرون لتحليل خلايا 18 </سوب>، 19، 20، 21 الأنسجة، أو الببتيدات المستهدفة 22. قمنا بتطوير تقنية مضاعفة تعزيز دعا الجمع بين سلف وصفها النظائر مع علامات إسوي الضغط (cPILOT). cPILOT العالمي هو مفيد للحصول على معلومات عن تركيزات النسبية لجميع البروتينات في ظروف عينة مختلفة (≥12) 14. ويبين الشكل 1 سير العمل cPILOT العام. وصفت زيتية أو ليز-C الببتيدات انتقائي في N-محطة مع dimethylation باستخدام انخفاض الرقم الهيدروجيني (2) وعلى بقايا يسين مع نوع plex 6 الكواشف باستخدام درجة الحموضة العالية. هذه الاستراتيجية تضاعف عدد العينات التي يمكن تحليلها مع الكواشف إسوي الضغط مما يساعد على تقليل تكاليف التجريبية وبالإضافة إلى ذلك، ويقلل من الخطوات التجريبية والوقت.
cPILOT مرنة كما قمنا بتطوير أساليب أخرى لدراسة مودى التأكسدي بعد متعديةfications، بما في ذلك البروتينات المعدلة 3-nitrotyrosine 14 والسيستين التي تحتوي على الببتيدات مع S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. وضعنا أيضا من الأحماض الأمينية نهج انتقائي، السيستين cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 الاستحواذ مع كبار أيون 11 أو انتقائية ذ 1 أيون طريقة 15 يمكن أن تساعد على تقليل مراسل تدخل أيون وتحسين دقة كمية من cPILOT. استخدام MS 3 في طريقة الشراء يتطلب أداة عالية الدقة مع محلل الشامل orbitrap على الرغم من دقة منخفضة أدوات فخ ايون قد تعمل أيضا (24).
سابقا، وقد استخدمت cPILOT لدراسة البروتينات في الكبد 16 من نموذج الفأر المرض مرض الزهايمر. هنا، نحن تصف كيفية إجراء تحليل cPILOT العالمي باستخدام الدماغ والقلب والكبد الخليط لدراسة دور peripheراي في مرض الزهايمر. وتتضمن هذه التجربة تكرار البيولوجي. بسبب براعة cPILOT، يمكن للمستخدمين المهتمين استخدام التقنية لدراسة الأنسجة الأخرى لمجموعة من المشاكل البيولوجية والأنظمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT يسمح لقياس وقت واحد من أكثر من 12 عينة فريدة من نوعها. من أجل ضمان وضع علامات ناجحة في كل من N-محطة ويسين بقايا من الببتيدات، لا بد أن يكون الرقم الهيدروجيني الصحيحة لكل مجموعة من ردود الفعل ولأداء رد فعل dimethylation أولا لوضع العلامات الببتيد. يتم تنفيذ dimethylation انتقائية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون تقر جامعة بيتسبرغ صناديق البدء والمعاهد الوطنية للصحة، منحة NIGMS R01 (GM 117191-01) لRASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
