Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)
Summary
Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.
Abstract
Es gibt eine steigende Nachfrage viele biologischen Proben für die Krankheit Verständnis und zur Entdeckung von Biomarkern zu analysieren. Quantitative Proteomik-Strategien, die gleichzeitige Messung mehrerer Proben ermöglichen haben sie weit verbreitet und stark experimentell Kosten und -zeiten reduzieren. Unser Labor entwickelt eine Technik namens kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT), die Ansätze Probe Multiplexen der traditionellen Isotopenmarkierung oder isobar Tagging verbessert. Globale cPILOT können auf Proben angewendet werden, die von Zellen stammen, Gewebe, Körperflüssigkeiten oder ganze Organismen und gibt Informationen über relative Proteinhäufigkeiten in verschiedenen Probenbedingungen. cPILOT arbeitet durch 1) Puffer mit niedrigeren pH Bedingungen unter Verwendung von Bedingungen , um selektiv dimethylate Peptid N-Termini und 2) mit hohem pH – Puffer mit im Handel erhältlichen Reagenzien isobaren primäre Amine der Lysinreste zu kennzeichnen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Der Grad derProbe Multiplexen verfügbar ist abhängig von der Anzahl von Vorläufern Etikett verwendet, und das isobare Markierungsreagens. Hier stellen wir eine 12-Plex-Analyse unter Verwendung von leichten und schweren Dimethylierung kombiniert mit sechs-plex isobaren Reagenzien 12 Proben von Geweben der Maus in einer einzigen Analyse zu analysieren. Verbessern Multiplexen ist hilfreich zur Reduzierung experimentelle Zeit und Kosten, und was noch wichtiger ist, so dass in vielen Vergleichsprobenbedingungen (biologische Replikaten, Krankheitsstadium, medikamentöse Behandlung, Genotypen oder longitudinale Zeitpunkt) mit weniger experimentellen Bias und Irrtum. In dieser Arbeit wird der globale cPILOT Ansatz zur Analyse Gehirn, Herzen und Lebergewebe durch biologische Replikate von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen. Globale cPILOT können andere biologische Prozesse angewandt werden, studieren und angepasst Probe Multiplexen von mehr als 20 Proben zu erhöhen.
Introduction
Proteomik beinhaltet oft die Analyse vielen Proben verwendet, um einen besseren Krankheitsprozess, Enzymkinetik, post-translationale Modifikationen, Reaktion auf Umweltreize, als Reaktion auf therapeutische Behandlungen, die Entdeckung neuer Biomarker oder Drogen Mechanismen zu verstehen. Quantitative Methoden können relative Unterschiede in Proteinspiegeln über die Proben zu messen, können verwendet werden, und markierungsfreie oder beinhalten Isotopenmarkierung (metabolic, chemische oder enzymatisch) werden. Stabilisotopenmarkierungsverfahren haben in der Popularität gewachsen, weil sie viele Proben erlauben gleichzeitig analysiert werden und eignen sich für Proben aus verschiedenen Zellen, Geweben, Körperflüssigkeiten oder ganzen Organismen. Isotopen – Markierungsverfahren 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Anstieg experimenteller Durchsatz,bei gleichzeitiger Reduzierung Erfassungszeit, Kosten und experimentelle Fehler. Diese Verfahren verwenden Vorläufermassenspektren relative Häufigkeiten von Proteinen aus Peptidpeaks zu messen. Im Gegensatz dazu isobaren Markierungsreagenzien 8, 9, 10 erzeugen Reporter – Ionen, die detektiert werden , entweder in MS / MS oder MS 3 11 Spektren und diese Peaks werden verwendet , auf dem relativen Abundanzen von Proteinen zu melden.
Die aktuelle Zustand-of-the-art in der Proteomik Multiplexen ist entweder eine 10-plex 12 oder 12-plex isobaren tag Analyse 13. Verbesserte Proben Multiplexing (dh> 10 Proben) Methoden wurden von unserem Labor für Gewebe 14 entwickelt, 15, 16, 17 und von anderen für die Analyse von Zellen 18 </sup>, 19, 20, Geweben 21 oder 22 gezielt Peptide. Wir entwickelten eine verbesserte Multiplex-Technik kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung mit isobar Tagging genannt (cPILOT). Globale cPILOT ist nützlich , um Informationen über die relativen Konzentrationen aller Proteine in den verschiedenen Probenbedingungen (≥12) 14. Abbildung 1 zeigt einen allgemeinen cPILOT Workflow. Tryptic oder Lys-C – Peptide am N-Terminus mit Dimethylierung unter Verwendung von niedrigem pH – Wert bei 2 und Lysinresten mit 6-Plex – Reagenzien unter Verwendung von hohem pH – Wert selektiv markiert. Diese Strategie verdoppelt die Anzahl der Proben, die mit isobar Reagenzien analysiert werden können, die Versuchskosten und zusätzlich zu reduzieren hilft, reduziert experimentelle Schritte und Zeit.
cPILOT ist flexibel, wie wir andere Methoden entwickelt haben oxidative post-translationale modi zu studierenfikationen, einschließlich 3-Nitrotyrosin-modifizierte Proteine 14 und Cystein enthaltenden Peptiden mit S-Nitrosylierung (oxcyscPILOT) 23. Wir haben auch eine Aminosäure-selektiven Ansatz, Cystein cPILOT (cyscPILOT) 17 entwickelt. MS 3 Erwerb mit einem Top-Ionen 11 oder selektiv-y 1 -Ion Verfahren 15 kann Reporter Ionen Interferenz reduzieren und quantitative Genauigkeit der cPILOT verbessern. Die Verwendung von MS 3 in dem Erfassungsverfahren erfordert ein hochauflösendes Gerät mit einem Orbitrap – Massenanalysator obwohl niedrige Auflösung lonenfalle Instrumente auch 24 arbeiten können.
Zuvor hat cPILOT verwendet Leberproteine 16 von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie die globale cPILOT Analyse unter Verwendung von Gehirn, Herz durchzuführen, und Leberhomogenisaten die Rolle des periphe zu studierenry in der Alzheimer-Krankheit. Dieses Experiment beinhaltet biologische Replikation. Aufgrund der Vielseitigkeit von cPILOT können interessierte Benutzer die Technik verwenden, um andere Gewebe für eine Reihe von biologischen Problemen und Systemen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehr als 12 einzigartigen Proben. Um bei erfolgreichen Tagging, um sicherzustellen, sowohl des N-Terminus und Lysinresten von Peptiden, ist es zwingend notwendig, den richtigen pH-Wert für jeden Satz von Reaktionen zu haben und die Dimethylierung Reaktion zunächst für die Peptidmarkierung durchzuführen. Selective Dimethylierung am N-Terminus wird durch einen pH-Wert bei etwa 2,5 (± 0,2) durchgeführt. Dies wird durch Ausnutzung der Unterschiede der pKa der Aminogrupp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen an der University of Pittsburgh-Startfonds und NIH, NIGMS R01 Zuschuss (GM 117191-01) zu RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
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