Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)
Summary
Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.
Abstract
V'è una crescente domanda di analizzare molti campioni biologici per la malattia di comprensione e di scoperta di biomarcatori. proteomica strategie quantitative che consentono la misurazione simultanea di più campioni sono diffusi e ridurre notevolmente i costi ei tempi sperimentali. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata precursore combinato etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot), che migliora campione multiplazione di etichettatura isotopica tradizionale o approcci di tagging isobariche. CPilot globale può essere applicato a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi e fornisce informazioni sulla abbondanza relativa proteina attraverso diverse condizioni del campione. CPilot funziona 1) usando condizioni di bassa tampone pH selettivamente peptide dimethylate N-terminali e 2) utilizzando condizioni tampone pH elevato etichettare ammine primarie di residui di lisina con reagenti isobariche commercialmente disponibili (vedere Tabella dei materiali / reagenti). Il grado dimultiplexing campione disponibile dipende dal numero di etichette precursori utilizzati e il reagente di marcatura isobarica. Qui, presentiamo un'analisi 12-plex usando la luce e dimethylation pesante combinato con sei-plex reagenti isobariche per analizzare 12 campioni di tessuti di topo in una singola analisi. multiplazione avanzata è utile per ridurre il tempo sperimentale e costi e, soprattutto, permettendo un confronto in molte condizioni del campione (repliche biologiche, stadio della malattia, trattamenti farmacologici, genotipi, o longitudinali time-punti) con pregiudizi meno sperimentale e l'errore. In questo lavoro, l'approccio globale CPilot viene utilizzato per analizzare il cervello, cuore e tessuti del fegato attraverso repliche biologiche dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. Globale CPilot può essere applicato per studiare altri processi biologici e atta ad aumentare campione multiplexing a più di 20 campioni.
Introduction
Proteomica spesso comporta l'analisi di molti campioni utilizzati per comprendere meglio i processi patologici, cinetica enzimatica, modificazioni post-traduzionali, risposta a stimoli ambientali, risposta ai trattamenti terapeutici, scoperta biomarker, o meccanismi di droga. metodi quantitativi possono essere impiegati per misurare differenze relative dei livelli delle proteine nei campioni di e può essere privo di etichetta o coinvolgere etichettatura isotopica (metabolica, chimica o enzimatica). Stabili metodi di etichettatura isotopo sono cresciuti in popolarità perché consentono molti campioni da analizzare simultaneamente e sono adatti per i campioni da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi. Metodi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentare la produttività sperimentale, marcatura isotopicariducendo il tempo di acquisizione, i costi, e l'errore sperimentale. Questi metodi utilizzano spettri di massa precursore per misurare abbondanze relative delle proteine da picchi peptide. Al contrario, i reagenti codifica isobariche 8, 9, 10 generano ioni giornalista che sono o rilevati in MS / MS o MS 3 11 spettri e questi picchi sono utilizzate per rilevare l'abbondanze relative di proteine.
L'attuale stato-of-the-art in proteomica multiplazione o è un 10-plex 12 o 12-plex analisi tag isobarica 13. Multiplexing campione maggiore (cioè> 10 campioni) metodi sono stati sviluppati dal nostro laboratorio per tessuti 14, 15, 16, 17, e da altri per l'analisi di cellule 18 </sup>, 19, 20, 21 tessuti, o peptidi mirati 22. Abbiamo sviluppato una tecnica di multiplexing migliorato chiamato combinato precursore etichettatura isotopica con marcatura isobarica (CPilot). CPilot globale è utile per ottenere informazioni sulle concentrazioni relative di tutte le proteine attraverso differenti condizioni del campione (≥12) 14. La figura 1 mostra una schema generale CPilot. Triptici o Lys-C peptidi sono selettivamente etichettati all'estremità N-terminale con dimethylation con bassi pH 2 ed a residui di lisina con 6-plex reagenti utilizzando pH elevato. Questa strategia raddoppia il numero di campioni che possono essere analizzati con reagenti isobariche che aiuta a ridurre i costi sperimentali e, inoltre, riduce i passaggi e il tempo sperimentali.
CPilot è flessibile abbiamo sviluppato altri metodi per studiare modi ossidativo post-traduzionalefiche, comprese le proteine 3-nitrotirosina modificati 14 e cisteina contenenti peptidi con S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Abbiamo anche sviluppato un aminoacido approccio selettivo, cisteina CPilot (cyscPILOT) 17. MS 3 acquisizione con un top-ione 11 o selettiva-y 1 ione metodo 15 può contribuire a ridurre l'interferenza degli ioni reporter e migliorare la precisione quantitativa di CPilot. L'uso di MS 3 nel metodo di acquisizione richiede uno strumento ad alta risoluzione con un analizzatore di massa Orbitrap sebbene bassa risoluzione strumenti trappola ionica possono anche funzionare 24.
In precedenza, CPilot è stato utilizzato per studiare le proteine del fegato 16 dal modello murino della malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo come eseguire l'analisi CPilot globale utilizzando cervello, cuore, fegato e omogenati per studiare il ruolo del periphery nella malattia di Alzheimer. Questo esperimento incorpora replica biologica. A causa della versatilità di CPilot, gli utenti interessati possono utilizzare la tecnica per studiare altri tessuti per una serie di problemi e sistemi biologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
CPilot consente la misura simultanea di più di 12 campioni unici. Al fine di garantire il tagging di successo sia a N-terminale e lisina residui di peptidi, è indispensabile avere il pH corretto per ogni serie di reazioni e di eseguire la reazione dimethylation prima per l'etichettatura peptide. dimethylation selettivo del N-terminale è effettuata da avere un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Questo risultato è ottenuto sfruttando le differenze dei PKA del dei gruppi amminici sulla lisina e N-terminale. A pH 2,5, la lisina ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono l'Università di Pittsburgh start-up fondi e NIH, NIGMS R01 concessione (GM 117.191-01) per RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
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