Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Summary

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Abstract

Existe una creciente demanda para analizar muchas muestras biológicas para la comprensión de la enfermedad y el descubrimiento de biomarcadores. estrategias proteómica cuantitativa que permiten la medición simultánea de múltiples muestras se han generalizado y reducir en gran medida los costes y los tiempos experimentales. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica llamada precursor combinado marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT), que mejora la muestra de multiplexación de marcaje isotópico tradicional o enfoques de etiquetado isobáricas. cPILOT Global se puede aplicar a las muestras procedentes de células, tejidos, fluidos corporales, o organismos completos y proporciona información sobre la abundancia relativa de proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra. cPILOT funciona por 1) usando condiciones de tampón de pH bajo para selectivamente péptido dimethylate N-terminales y 2) usando condiciones de tampón de pH alto para etiquetar aminas primarias de residuos de lisina con reactivos isobáricas comercialmente disponibles (véase la Tabla de Materiales / Reactivos). El grado demultiplexación muestra disponible depende del número de etiquetas precursores utilizados y el reactivo de marcado isobárica. A continuación, presentamos un análisis de 12-plex usando luz y dimetilación pesado combinado con seis plex reactivos isobáricas para analizar 12 muestras de tejidos de ratón en un solo análisis. multiplexación mejorada es útil para reducir el tiempo y el coste experimental y lo más importante, lo que permite la comparación a través de muchas condiciones de la muestra (réplicas biológicas, estadio de la enfermedad, los tratamientos con fármacos, genotipos, o longitudinales puntos de tiempo) con sesgo menos experimental y error. En este trabajo, el enfoque cPILOT global se utiliza para analizar el cerebro, el corazón, el hígado y los tejidos biológicos a través de repeticiones de los controles modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de Alzheimer. Global cPILOT se puede aplicar para estudiar otros procesos biológicos y adaptado para aumentar la multiplexación muestra a mayor de 20 muestras.

Introduction

Proteómica menudo implica el análisis de muchas muestras utilizadas para comprender mejor los procesos de enfermedad, la cinética enzimática, modificaciones post-traduccionales, de respuesta a los estímulos ambientales, de la respuesta a los tratamientos terapéuticos, el descubrimiento de biomarcadores, o mecanismos de drogas. Los métodos cuantitativos se pueden emplear para medir diferencias relativas en los niveles de proteína a través de las muestras y puede ser libre de etiqueta o implicar marcaje isotópico (metabólica, química o enzimática). métodos de marcaje de isótopos estables han crecido en popularidad debido a que permiten muchas muestras a ser analizadas simultáneamente y son adecuados para muestras de diferentes células, tejidos, fluidos corporales, u organismos enteros. Los métodos ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} aumentar el rendimiento experimental, el etiquetado de isótoposal tiempo que reduce el tiempo de adquisición, los costos, y el error experimental. Estos métodos utilizan los espectros de masas precursor para medir la abundancia relativa de las proteínas de picos de péptidos. En contraste, los reactivos de marcado isobáricas ^{8, 9, 10} generan iones informadores que se detectan ya sea en MS / MS o MS ^{3 11} espectros y estos picos se utilizan para informar sobre la abundancia relativa de las proteínas.

El estado de la técnica actual en la multiplexación proteómica es o bien un 10-plex ¹² o 12-plex análisis etiqueta isobárica ^13. Multiplexación muestra mejorada (es decir,> 10 muestras) métodos han sido desarrollados por nuestro laboratorio para los tejidos ^{14, 15, 16, 17,} y por otros para el análisis de células ¹⁸ </^{sup>, 19, 20, 21} tejidos, o péptidos dirigidos ^22. Hemos desarrollado una técnica de multiplexación mejorado denominado precursor de marcaje isotópico combinado con etiquetado isobárico (cPILOT). CPILOT Global es útil para obtener información acerca de las concentraciones relativas de todas las proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra (≥12) ^14. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo general cPILOT. Trípticos o Lys-C péptidos se etiquetan de forma selectiva en el extremo N-terminal con dimetilación usando bajo pH ² y en los residuos de lisina con 6-plex reactivos usando pH alto. Esta estrategia se duplica el número de muestras que se pueden analizar con reactivos isobáricas que ayuda a reducir los costos experimentales y, además, reduce pasos y el tiempo de experimentación.

cPILOT es flexible ya que hemos desarrollado otros métodos para estudiar la modificación oxidativa después de la traducciónficaciones, incluyendo proteínas 3-nitrotirosina modificado ¹⁴ y de cisteína que contiene péptidos con S-nitrosilación (oxcyscPILOT) ^23. También hemos desarrollado un aminoácido enfoque selectivo, cPILOT cisteína (cyscPILOT) ^17. MS ³ adquisición con una parte superior de iones de ¹¹ o selectiva-y ₁ -ion método ¹⁵ puede ayudar a reducir la interferencia de iones reportero y mejorar la precisión cuantitativa de cPILOT. El uso de MS ³ en el método de adquisición requiere un instrumento de alta resolución con un analizador de masas orbitrap aunque de baja resolución instrumentos trampa de iones también pueden trabajar ^24.

Anteriormente, cPILOT se ha utilizado para estudiar las proteínas hepáticas ¹⁶ de modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. A continuación, describimos cómo realizar análisis global cPILOT utilizando el cerebro, el corazón y el hígado homogeneizado para estudiar el papel de la peripheria en la enfermedad de Alzheimer. Este experimento incorpora replicación biológica. Debido a la versatilidad de cPILOT, los usuarios interesados ​​pueden utilizar la técnica para estudiar otros tejidos para una serie de problemas y sistemas biológicos.

Protocol

Ética declaración: Los ratones fueron adquiridos de una institución independiente de investigación biomédica, sin ánimo de lucro y alojados en la División de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pittsburgh. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh. 1. extracción de proteínas y la generación de péptidos de Química-etiquetado Extracto de proteína a pa…

Representative Results

cPILOT utiliza la química basado en amina a químicamente péptidos de la etiqueta en el extremo N-terminal y los residuos de lisina y mejora las capacidades de multiplexado de la muestra. La Figura 2 muestra los datos de MS representante que se obtiene a partir de un análisis cPILOT 12-plex de cerebro, el corazón y los tejidos del hígado de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer. Como se muestra en la Tabla 1,</s…

Discussion

cPILOT permite la medición simultánea de más de 12 muestras únicas. A fin de garantizar el etiquetado exitosa tanto en el N-terminal y lisina residuos de péptidos, es imperativo para que el pH correcto para cada conjunto de reacciones y para llevar a cabo la reacción dimetilación primero para el etiquetado del péptido. dimetilación selectiva en el extremo N-terminal se realiza por tener un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Esto se consigue mediante la explotación de las diferencias de los valores de pKa de los grupos amino…

Materials

Water – MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile – MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1cc (10 mg)   extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	–	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	–	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient.
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a ph meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of ph buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand ph buffer 7  is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.