Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)

Published: May 01, 2017

doi:

Christina D. King, Joseph D. Dudenhoeffer, Liqing Gu, Adam R. Evans, Renã A. S. Robinson

¹Department of Chemistry,University of Pittsburgh, ²SGS North America Inc., ³Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science,Janssen Research and Development

Summary

संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) एक मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स रणनीति है कि समदाब रेखीय टैग की नमूना बहुसंकेतन क्षमताओं को बढ़ाता है है। यह प्रोटोकॉल एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण से ऊतकों को cPILOT के आवेदन का वर्णन है।

Abstract

वहाँ एक बढ़ती मांग बीमारी समझ और बायोमार्कर की खोज के लिए कई जैविक नमूनों का विश्लेषण किया जा सके। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स रणनीतियों कि कई नमूनों के एक साथ माप व्यापक हो गया है और बहुत प्रयोगात्मक लागत और समय को कम करने की अनुमति है। हमारी प्रयोगशाला एक तकनीक संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) कहा जाता है, जो परंपरागत समस्थानिक लेबलिंग या समदाब रेखीय टैगिंग तरीकों में से नमूना बहुसंकेतन को बढ़ाता है विकसित की है। वैश्विक cPILOT कोशिकाओं, ऊतकों, शरीर के तरल पदार्थ, या पूरे जीवों से होने वाले नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न नमूना स्थिति भर सापेक्ष प्रोटीन प्रचुरता के बारे में जानकारी देता है। cPILOT 1 से काम करता है) कम पीएच बफर शर्तों का उपयोग चुनिंदा dimethylate पेप्टाइड एन टर्मिनी और 2) उच्च पीएच बफर शर्तों का उपयोग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध समदाब रेखीय अभिकर्मकों के साथ लाइसिन अवशेषों के प्राथमिक amines लेबल करने के लिए (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)। की उपाधिनमूना बहुसंकेतन उपलब्ध इस्तेमाल किया अग्रदूत लेबल की संख्या और समदाब रेखीय टैगिंग अभिकर्मक पर निर्भर है। यहाँ, हम प्रकाश और भारी dimethylation छह plex समदाब रेखीय अभिकर्मकों के साथ संयुक्त रूप से एक विश्लेषण में माउस ऊतकों से 12 नमूनों का विश्लेषण करने के लिए का उपयोग कर एक 12 plex विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं। बढ़ी बहुसंकेतन कम प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह और त्रुटि के साथ, प्रयोगात्मक समय और लागत को कम करने और अधिक महत्वपूर्ण कई नमूना की स्थिति (जैविक प्रतिकृति, रोग चरण, नशीली दवाओं के उपचार, जीनोटाइप, या अनुदैर्ध्य समय-अंक) भर में तुलना करने के लिए उपयोगी है। इस काम में, वैश्विक cPILOT दृष्टिकोण एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण से मस्तिष्क, हृदय, और जैविक प्रतिकृति भर में जिगर के ऊतकों का विश्लेषण किया जाता है। वैश्विक cPILOT अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है और अधिक से अधिक 20 से नमूने के लिए नमूना बहुसंकेतन बढ़ाने के लिए अनुकूलित।

Introduction

प्रोटिओमिक्स अक्सर कई बेहतर रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया नमूने, एंजाइम गतिकी, बाद translational संशोधनों, पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब, चिकित्सीय उपचार, बायोमार्कर की खोज, या दवा तंत्र के जवाब का विश्लेषण शामिल है। मात्रात्मक पद्धतियों के नमूने भर में प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार मतभेद को मापने और लेबल से मुक्त किया जा सकता है या समस्थानिक लेबलिंग (चयापचय, रसायन, या एंजाइमी) को शामिल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तरीकों लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, क्योंकि वे कई नमूने एक साथ विश्लेषण करने की अनुमति देते हैं और विभिन्न कोशिकाओं, ऊतकों, शरीर के तरल पदार्थ, या पूरे जीवों से नमूने लिए उपयुक्त हैं। आइसोटोप लेबलिंग तरीकों ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ⁷ वृद्धि प्रयोगात्मक throughput,जबकि अधिग्रहण समय, लागत, और प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने। इन विधियों अग्रदूत जन स्पेक्ट्रा का उपयोग पेप्टाइड चोटियों से प्रोटीन के रिश्तेदार abundances को मापने के लिए। इसके विपरीत, समदाब रेखीय टैगिंग अभिकर्मकों ^{^8,} ^{^9,} ¹⁰ रिपोर्टर आयनों है कि या तो एमएस / एमएस या एमएस में पाया जाता है उत्पन्न ³ ¹¹ स्पेक्ट्रा और इन चोटियों प्रोटीन के रिश्तेदार abundances पर रिपोर्ट किया जाता है।

वर्तमान प्रोटिओमिक्स बहुसंकेतन में राज्य के अत्याधुनिक या तो एक 10 plex ¹² या 12-plex समदाब रेखीय टैग विश्लेषण ¹³ है। बढ़ी नमूना बहुसंकेतन (यानी> 10 नमूने) तरीकों हमारे प्रयोगशाला द्वारा ऊतकों ^{^14,} ^{^15,} ^{^16,} ¹⁷ के लिए कोशिकाओं ¹⁸ के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, और दूसरों के द्वारा </^sup>, ^{^19,} ^20, ^21, या लक्षित पेप्टाइड्स ²² ऊतकों। हम समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) के साथ संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग नामक एक बढ़ाया बहुसंकेतन तकनीक विकसित की है। वैश्विक cPILOT विभिन्न नमूना की स्थिति (≥12) ¹⁴ के पार सभी प्रोटीन के रिश्तेदार सांद्रता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोगी है। चित्रा 1 एक सामान्य cPILOT कार्यप्रवाह को दर्शाता है। Tryptic या लिस-सी पेप्टाइड्स चुनिंदा कम पीएच ² का उपयोग dimethylation साथ N- टर्मिनस पर और उच्च पीएच का उपयोग कर 6-plex अभिकर्मकों के साथ लाइसिन अवशेषों पर लेबल रहे हैं। इस रणनीति डबल्स के नमूने है कि समदाब रेखीय अभिकर्मकों प्रयोगात्मक लागत और इसके अलावा कम करने में मदद जिसके साथ विश्लेषण किया जा सकता की संख्या, प्रयोगात्मक कदम और समय कम कर देता है।

cPILOT लचीला है के रूप में हम ऑक्सीडेटिव बाद अनुवादकीय मोदी अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों का विकास किया हैfications, 3-nitrotyrosine संशोधित प्रोटीन ¹⁴ और एस nitrosylation (oxcyscPILOT) ²³ के साथ सिस्टीन युक्त पेप्टाइड सहित। हम यह भी एक अमीनो अम्ल चयनात्मक दृष्टिकोण, सिस्टीन cPILOT (cyscPILOT) ¹⁷ विकसित किया है। एक शीर्ष आयन ¹¹ या चुनिंदा-y _1-आयन विधि ¹⁵ के साथ एमएस ³ अधिग्रहण में मदद कर सकते संवाददाता आयन हस्तक्षेप को कम करने और cPILOT की मात्रात्मक सटीकता में सुधार। अधिग्रहण विधि में एमएस ³ का उपयोग एक Orbitrap जन विश्लेषक के साथ एक उच्च संकल्प विधि की आवश्यकता होती है, हालांकि कम संकल्प आयन जाल वाद्ययंत्रों को भी ²⁴ काम कर सकते हैं।

इससे पहले, cPILOT एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल से जिगर प्रोटीन ¹⁶ अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम कैसे periphe की भूमिका का अध्ययन करने के मस्तिष्क, हृदय, और जिगर homogenates का उपयोग कर वैश्विक cPILOT विश्लेषण करने के लिए का वर्णनअल्जाइमर रोग में ry। इस प्रयोग जैविक प्रतिकृति को शामिल किया गया। cPILOT की बहुमुखी प्रतिभा की वजह से, इच्छुक उपयोगकर्ताओं जैविक समस्याओं और सिस्टम की एक श्रृंखला के लिए अन्य ऊतकों का अध्ययन करने के तकनीक का उपयोग कर सकते हैं।

Protocol

आचार कथन: चूहे एक स्वतंत्र, गैर लाभ जैव चिकित्सा अनुसंधान संस्थान से खरीदा है और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन विभाग में रखे गए थे। सभी पशु प्रोटोकॉल पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में…

Representative Results

cPILOT N- टर्मिनस और लाइसिन अवशेषों पर लेबल पेप्टाइड्स लिए रासायनिक को अमाइन आधारित रसायन शास्त्र का उपयोग करता है और नमूना बहुसंकेतन क्षमताओं को बढ़ाता है। चित्रा 2 प्रतिनिधि एमएस डेटा…

Discussion

cPILOT 12 से अधिक अद्वितीय नमूने के एक साथ माप के लिए अनुमति देता है। आदेश पेप्टाइड्स के दोनों N- टर्मिनस और लाइसिन अवशेषों में सफल टैगिंग सुनिश्चित करने के लिए है, यह प्रतिक्रियाओं के प्रत्येक सेट के लिए सही …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों RASR को पिट्सबर्ग प्रारंभ हुआ फंड के विश्वविद्यालय और एनआईएच, NIGMS R01 अनुदान (जीएम 117,191-01) स्वीकार करते हैं।

Materials

Water – MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile – MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH₂O) solution; 36.5 – 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (¹³CD₂O) solution; 20 wt % in D₂O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C₁₈ cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	–	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	–	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient.
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a ph meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of ph buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand ph buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C₁₈ packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.
C₁₈ packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.

References

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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).