Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)
Summary
Kombineret precursor isotopmærkning og isobar tagging (cPILOT) er en kvantitativ proteomics strategi, der forbedrer prøve multiplexing kapaciteter isobare tags. Denne protokol beskriver anvendelsen af cPILOT til væv fra et Alzheimers sygdom-musemodel og vildtypekontroller.
Abstract
Der er en stigende efterspørgsel til at analysere mange biologiske prøver til sygdom forståelse og biomarkør opdagelse. Kvantitative proteomics strategier, der tillader samtidig måling af flere prøver er blevet udbredt og i høj grad reducere eksperimentelle omkostninger og tider. Vores laboratorium udviklet en teknik kaldet kombineret forstadium isotopmærkning og isobar tagging (cPILOT), hvilket forbedrer prøve multipleksing af traditionel isotopmærkning eller isobare tagging tilgange. Global cPILOT kan anvendes på prøver hidrørende fra celler, væv legemsvæsker eller hele organismer og giver information om de relative protein forekomster på tværs af forskellige prøvebetingelser. cPILOT virker ved 1) anvendelse af lave pH bufferbetingelser for selektivt dimethylate peptid N-terminaler og 2) ved hjælp af høj pH bufferbetingelser at mærke primære aminer med lysinrester med kommercielt tilgængelige isobare reagenser (se tabel of Materials / Reagenser). Graden afprøve multiplexing tilgængelig er afhængig af antallet af prækursor anvendte etiketter og isobare tagging reagens. Her præsenteres en 12-plex analyse ved anvendelse let og tung dimethylering kombineret med seks-plex isobare reagenser til at analysere 12 prøver fra musevæv i en enkelt analyse. Forbedret multipleksering er nyttig til reduktion af eksperimentel tid og omkostninger og endnu vigtigere, tillader sammenligning på tværs af mange prøvebetingelser (biologiske replikater, sygdomsstadie, medicinsk behandling, genotyper eller langsgående tidspunkter) med mindre eksperimentelle bias og fejl. I dette arbejde er det globale cPILOT fremgangsmåde anvendes til at analysere hjerne, hjerte, og levervæv tværs biologiske gentagelser fra en Alzheimers sygdom musemodel og vildtypekontroller. Global cPILOT kan anvendes til at studere andre biologiske processer og er indrettet til at øge prøve multiplexing til over 20 prøver.
Introduction
Proteomics involverer ofte analyse af mange prøver anvendt til bedre at forstå sygdomsprocesser, enzym kinetik, post-translationelle modifikationer, respons på miljømæssige stimuli, reaktion til terapeutiske behandlinger, biomarkører eller narkotika mekanismer. Kvantitative metoder kan anvendes til at måle de relative forskelle i proteinniveauer tværs prøverne og kan være etiket-fri eller involvere isotopmærkning (metabolisk, kemisk eller enzymatisk). Stabile metoder isotop mærkning er vokset i popularitet, fordi de tillader mange prøver, der skal analyseres samtidigt og er velegnet til prøver fra forskellige celler, væv legemsvæsker eller hele organismer. Isotopmærkning metode 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 stigning eksperimentel gennemløb,samtidig reducere købet tid, omkostninger og eksperimentel fejl. Disse fremgangsmåder anvender precursor massespektre til at måle relative mængder af proteiner fra peptidtoppe. I modsætning hertil isobare tagging reagenser 8, 9, 10 generere reporter ioner, der enten er detekteret i MS / MS eller MS 3 11 spektre og disse toppe anvendes til at rapportere om relativ hyppighed af proteiner.
Den nuværende state-of-the-art i proteomics multiplexing er enten en 10-plex 12 eller 12-plex isobar tag analyse 13. Forbedret prøve multiplexing (dvs.> 10 prøver) metoder er blevet udviklet af vores laboratorium for væv 14, 15, 16, 17, og af andre til analyse af celler 18 </sup>, 19, 20, væv 21 eller målrettede peptider 22. Vi udviklede en forbedret multiplexing teknik kaldet kombineret forstadium isotopmærkning med isobar tagging (cPILOT). Global cPILOT er nyttig til at hente information om de relative koncentrationer af alle proteiner på tværs af forskellige prøvebetingelser (≥12) 14. Figur 1 viser en generel cPILOT arbejdsgang. Tryptiske eller Lys-C peptider er selektivt mærket ved N-terminalen med dimethylering anvendelse af lav pH 2 og ved lysinrester med 6-plex reagenser ved hjælp af høj pH. Denne strategi fordobler antallet af prøver, der kan analyseres med isobare reagenser, som bidrager til at reducere eksperimentelle omkostninger og derudover reducerer eksperimentelle trin og tid.
cPILOT er fleksibel som vi har udviklet andre metoder til at studere oxidativ posttranslationel modifikationer, herunder 3-nitrotyrosin-modificerede proteiner 14 og cysteinholdige peptider med S-nitrosylering (oxcyscPILOT) 23. Vi har også udviklet en aminosyre selektiv tilgang, cystein cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 erhvervelse med en top-ion 11 eller selektiv-y1 -ion metode 15 kan reducere reporter ion interferens og forbedre kvantitativ nøjagtighed cPILOT. Anvendelsen af MS 3 i erhvervelse fremgangsmåde kræver en høj opløsning instrument med en orbitrap masseanalysator selvom lav opløsning ion trap instrumenter også kan arbejde 24.
Tidligere har cPILOT blevet anvendt til at undersøge leverproteiner 16 fra en Alzheimers sygdom musemodel. Her beskriver vi, hvordan du udfører globale cPILOT analyse ved hjælp af hjerne, hjerte og lever homogenater at studere rolle periphery i Alzheimers sygdom. Dette forsøg omfatter biologisk replikation. På grund af den alsidighed cPILOT, kan interesserede brugere bruge teknikken til at studere andre væv for en række biologiske problemer og systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT giver mulighed for samtidig måling af mere end 12 unikke prøver. For at sikre en vellykket tagging på både N-terminalen og lysinrester af peptider, er det bydende nødvendigt at have den korrekte pH-værdi for hvert sæt af reaktioner og udføre dimethylering reaktionen først for peptid mærkning. Selektiv dimethylering i N-terminus udføres ved at have en pH på ~ 2,5 (± 0,2). Dette opnås ved at udnytte forskellene i pKa s af aminogrupperne på lysin og N-terminus. Ved pH 2,5, lysin er inaktiv (pKA ~ 10,5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkender University of Pittsburgh startfonde og NIH, NIGMS R01 tilskud (GM 117.191-01) til RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
