Peptid Scanning-assisteret Identifikation af et monoklonalt antistof-anerkendt Linear B-celleepitop
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
Identifikationen af en antigen epitop af immunsystemet giver mulighed for at forstå den beskyttende mekanisme af neutraliserende antistoffer, som kan fremme udviklingen af vacciner og peptidlægemidler. Peptid scanning er en enkel og effektiv metode, ligefremt kortlægger den lineære epitop genkendes af et monoklonalt antistof (mAb). Her, forfatterne præsenterer en epitop bestemmelse metode involverer serielt trunkerede rekombinante proteiner, syntetisk peptid design og dot-blot hybridisering for den antigene anerkendelse af nervøs nekrose viruscoat-protein under anvendelse af et neutraliserende mAb. Denne teknik bygger på dot-blot-hybridisering af syntetiske peptider og mAb'er på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den mindste antigene region af et viralt kappeprotein genkendes af RG-M56 mAb kan indsnævres ved trin-for-trin trimmet peptidkortlægning på en 6-mer peptid epitop. Desuden alaninscanningsmutagenese og restprodukt substitution kan udføres for at karakterisere bindingen betydning af hver aminosyrerest, der udgør epitopen. Resterne flankerer epitop stedet viste sig at spille kritiske roller i peptid kropsbygning regulering. Den identificerede epitop peptid kan anvendes til at danne krystaller af epitop peptid-antistof komplekser til en x-ray diffraktion undersøgelse og funktionel konkurrence eller til terapeutiske midler.
Introduction
I immunsystemet, rekombination af V, D og J-segmenter giver mulighed for antistoffer mod skabe enorme variationer af komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) for binding til forskellige antigener til at beskytte værten mod patogen infektion. Den neutraliserende forsvar af antistoffer mod antigener afhænger af den rumlige komplementaritet mellem CDR'erne af antistofferne og epitoperne af antigenerne. Derfor vil en forståelse af denne molekylære interaktion bistå profylaktisk vaccine design og terapeutisk peptid lægemiddeludvikling. Dette kan dog neutralisering interaktion påvirkes både af flere antigene domæner fra et enkelt antigen og ved multiple CDR'er af antistoffer, som derfor gør epitop bestemmelsesproces mere kompleks. Heldigvis udviklingen af hybridomteknologi, som sammensmelter individuelle antistofproducerende celler med myelomaceller, giver mulighed for en konstant dividere batch af celler til secrete én specifikt antistof, er kendt som et monoklonalt antistof (mAb) 1. Hybridomaceller producerer disse rene, høj affinitet mAb'er til at binde til et enkelt antigent domæne af et specifikt antigen. Med forholdet af antigen-antistof etableret, flere tilgange, herunder peptid scanning, kan anvendes til at bestemme epitopen af et antigen ved hjælp af dens tilsvarende mAb. Den seneste udvikling i syntetisk peptid-teknologi har gjort peptidet skanningsteknik mere tilgængelig og mere bekvemt at udføre. Kort fortalt et sæt af overlappende syntetiske peptider fremstillet ifølge et målantigen sekvens og er knyttet til en fast-understøttet membran til mAb hybridisering. Peptidscanning ikke kun tilbyder en enkel måde at kortlægge antistofbindende region, men også letter aminosyre (aa) mutagenese gennem rest scanning eller substitution at evaluere bindingsinteraktionen mellem hver aa rest af epitopen peptidet og CDR'erne i antistoffet.
<p class = "jove_content"> Her den foreliggende undersøgelse beskriver en protokol for en effektiv identifikation af den lineære epitop af det gule grouper nervøs nekrose-virus (YGNNV) kappeprotein under anvendelse af et neutraliserende mAb 2, 3, 4. Protokollen indeholder mAb forberedelse, konstruktion og udtryk for serielt trunkerede rekombinante proteiner, syntetisk overlappende peptid design, dot-blot hybridisering, alaninscanning og substitution mutagenese. I betragtning af den høje pris for peptidsyntese, blev trinet med serielt trunkering af rekombinante proteiner med en ønsket målprotein modificeret, og den antigene region blev indsnævret til omkring 100 til 200 aa rester før det syntetiske peptid-array dot-blot-analyse blev udført.Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en enkel og hurtig teknik til at identificere et mAb-anerkendt lineær epitop. Under hensyntagen til omkostningerne ved peptidsyntese og produktionseffektiviteten til syntetisering peptider, blev den antigene region af viruscoat-proteinet reduceres ved at udtrykke serielt trunkerede rekombinante proteiner før peptidscanning analyse. Som sådan blev pålidelig og effektiv E. coli pET udtryk, der anvendes til at producere disse serielt trunkerede rekombinante proteiner, som rekombinante prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
