Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा एक प्रतिजनी मिलान की पहचान एंटीबॉडी कि टीकों और पेप्टाइड दवाओं के विकास की सुविधा हो सकती निष्क्रिय करने की सुरक्षा व्यवस्था को समझने के लिए अनुमति देता है। पेप्टाइड स्कैनिंग एक सरल और कारगर तरीका है कि सीधी रेखीय मिलान एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) द्वारा मान्यता प्राप्त नक्शे है। इधर, लेखकों एक मिलान दृढ़ संकल्प एक निष्क्रिय एमएबी का उपयोग करते हुए नर्वस नेक्रोसिस वायरस कोट प्रोटीन की प्रतिजनी मान्यता के लिए क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन, सिंथेटिक पेप्टाइड डिजाइन, और डॉट धब्बा संकरण से जुड़े कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं। इस तकनीक में एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर सिंथेटिक पेप्टाइड्स और MABS के डॉट-धब्बा संकरण पर निर्भर करता है। एक वायरल कोट प्रोटीन आरजी M56 एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त की न्यूनतम प्रतिजनी क्षेत्र कदम-दर-कदम से नीचे संकुचित किया जा सकता है कि एक 6-मेर पेप्टाइड मिलान पर पेप्टाइड मानचित्रण छंटनी की। इसके अलावा, alanine स्कैनिंग mutagenesis और अवशेषों उपstitution प्रत्येक अमीनो एसिड मिलान को बनाने के अवशेषों के बंधन महत्व को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। मिलान साइट flanking अवशेषों पेप्टाइड रचना नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए पाए गए। पहचान मिलान पेप्टाइड एक एक्स-रे विवर्तन अध्ययन और कार्यात्मक प्रतियोगिता, या चिकित्सा विज्ञान के लिए के लिए मिलान पेप्टाइड एंटीबॉडी परिसरों के क्रिस्टल फार्म का उपयोग किया जा सकता है।
प्रतिरक्षा प्रणाली में, वी, डी, और जम्मू क्षेत्रों के पुनर्संयोजन एंटीबॉडी विभिन्न एंटीजन के लिए बाध्य रोगजनक संक्रमण से मेजबान की रक्षा के लिए पूरकता का निर्धारण क्षेत्रों (सीडीआर) की जबरदस्त रूपों बनाने के लिए अनुमति देता है। एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के उदासीन रक्षा एंटीबॉडी के सीडीआर और एंटीजन की epitopes के बीच स्थानिक पूरकता पर निर्भर करता है। इसलिए, इस आणविक बातचीत की समझ के रोगनिरोधी वैक्सीन डिजाइन और चिकित्सीय पेप्टाइड दवा के विकास में मदद करेंगे। हालांकि, इस निराकरण बातचीत दोनों एक ही प्रतिजन से कई प्रतिजनी डोमेन और एंटीबॉडी के कई सीडीआर, जिसके फलस्वरूप मिलान निर्धारण प्रक्रिया को और अधिक जटिल बनाने से प्रभावित किया जा सकता है। सौभाग्य से, हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी के विकास, जो मायलोमा कोशिकाओं के साथ अलग-अलग एंटीबॉडी उत्पादक कोशिकाओं फ़्यूज़, सेकंड के लिए कोशिकाओं का एक लगातार विभाजित बैच के लिए अनुमति देता हैजाल एक विशिष्ट एंटीबॉडी, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के रूप में जाना जाता है 1। हाइब्रिडोमा कोशिकाओं को एक विशिष्ट प्रतिजन का एक भी प्रतिजनी डोमेन के लिए बाध्य करने के लिए इन शुद्ध, उच्च आत्मीयता MABS का उत्पादन। प्रतिजन प्रतिरक्षी की स्थापना की, पेप्टाइड स्कैनिंग सहित कई दृष्टिकोण के संबंध के साथ, एक प्रतिजन अपनी इसी एमएबी का उपयोग करने का मिलान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिंथेटिक पेप्टाइड प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम पेप्टाइड स्कैनिंग तकनीक को और अधिक सुलभ और अधिक प्रदर्शन करने के लिए सुविधाजनक बना दिया है। संक्षेप में, ओवरलैपिंग सिंथेटिक पेप्टाइड्स का एक सेट के लक्ष्य प्रतिजन अनुक्रम के अनुसार उत्पादन कर रहे हैं और एमएबी संकरण के लिए एक ठोस समर्थित झिल्ली से जुड़े हुए हैं। पेप्टाइड स्कैनिंग न केवल एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षेत्र नक्शा करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, लेकिन यह भी अवशेषों स्कैनिंग या प्रतिस्थापन के माध्यम से अमीनो एसिड (एए) mutagenesis की सुविधा मिलान पेप्टाइड का प्रत्येक हूँ अवशेषों और एंटीबॉडी की सीडीआर के बीच बाध्यकारी बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए।
<p cलड़की = "jove_content"> यहाँ, वर्तमान अध्ययन पीले ग्रूपर नर्वस नेक्रोसिस वायरस (YGNNV) कोट प्रोटीन एक निष्क्रिय एमएबी 2, 3, 4 का उपयोग कर के रैखिक मिलान के कुशल पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल एमएबी तैयारी, निर्माण और क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सिंथेटिक ओवरलैपिंग पेप्टाइड डिजाइन, डॉट-धब्बा संकरण, alanine स्कैनिंग, और प्रतिस्थापन म्युटाजेनेसिस भी शामिल है। पेप्टाइड संश्लेषण की उच्च लागत को देखते हुए, क्रमानुसार एक वांछित लक्ष्य प्रोटीन की पुनः संयोजक प्रोटीन को काटे के कदम संशोधित किया गया था, और प्रतिजनी क्षेत्र के आसपास 100 से 200 हूँ अवशेषों के लिए नीचे संकुचित था इससे पहले कि सिंथेटिक पेप्टाइड सरणी डॉट धब्बा विश्लेषण किया गया था।इस प्रोटोकॉल एक एमएबी स्तर पर मान्यता प्राप्त रैखिक मिलान की पहचान करने के लिए एक तेजी से और सरल तकनीक प्रदान करता है। ध्यान में पेप्टाइड संश्लेषण और synthesizing पेप्टाइड्स की उत्पादन क्षमता की लागत ले रहा ह?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |