Peptid Skanning-assistert Identifisering av et monoklonalt antistoff-gjenkjent Linear B-celle-epitop

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

Identifiseringen av en antigen epitop av immunsystemet åpner for forståelsen av den beskyttende mekanisme av nøytraliserende antistoffer som kan fremme utvikling av vaksiner og peptid narkotika. Peptid-skanning er en enkel og effektiv metode som oversiktlig kartlegger lineær epitop som gjenkjennes av et monoklonalt antistoff (mAb). Her forfatterne presenterer en epitop besluttsomhet metodikk som involverer serielt avkortede rekombinante proteiner, syntetisk peptid design, og dot-blot hybridisering for antigen anerkjennelse av nervøs nekrose virus kappeproteinet ved hjelp av en nøytraliserende mAb. Denne teknikk er avhengig av dot-blot-hybridisering av syntetiske peptider og mAb'er på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den minimale antigene region av et viralt kappeprotein som gjenkjennes av RG-M56 mAb kan begrenses ved steg-for-steg trimmet peptidkartlegging på en 6-mer peptid-epitop. I tillegg, alanin mutagenese og residuet ble underGrunnloven kan bli utført for å karakterisere bindingen betydningen av hver aminosyrerest som utgjør epitopen. Restene flankerer epitop nettstedet ble funnet å spille viktige roller i peptid konformasjon regulering. Den identifiserte epitop peptidet kan bli anvendt for å danne krystaller av epitop peptid-antistoff-komplekser for en røntgendiffraksjon studium og funksjonell konkurranse, eller for terapeutiske midler.

Introduction

I immunsystemet, det rekombinasjon av V, D og J segmentene gjør det mulig for antistoffer til å skape store variasjoner av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) for binding til forskjellige antigener for å beskytte verten fra sykdomsfremkallende infeksjon. Den nøytraliserende forsvar av antistoffer mot antigener som er avhengig av den romlige komplementaritet mellom CDR'ene fra antistoffene og epitoper av antigenene. Derfor vil en forståelse av denne molekylær interaksjon hjelpe profylaktisk vaksine utforming og terapeutiske peptidlegemiddel-utvikling. Dette kan imidlertid nøytralisering interaksjonen bli påvirket både av flere antigene domener fra ett enkelt antigen, og av flere CDR fra antistoffer, som dermed gjør det epitop bestemmelse prosessen mer kompleks. Heldigvis utvikling av hybridoma-teknologi, som sikringer individuelle antistoffproduserende celler med myelomceller, gjør det mulig for en kontinuerlig delende gruppe med celler for å sekrete en spesifikt antistoff, kjent som et monoklonalt antistoff (mAb) ^1. Hybridomceller som produserer slike ren, høy-affinitets mAb til å bindes til en enkelt antigenisk område av et spesifikt antigen. Med forholdet mellom antigen-antistoff-etablert, flere fremgangsmåter, inkludert peptid skanning, kan brukes til å bestemme den epitop av et antigen ved hjelp av tilsvarende mAb. Den siste utviklingen i syntetisk peptid teknologi har gjort peptid skanning teknikk mer tilgjengelig og mer praktisk å utføre. I korthet er et sett av overlappende syntetiske peptider fremstilt i henhold til et mål-antigen sekvens og er forbundet til en fast støttede membran for mAb hybridisering. Peptid skanning ikke bare gir en enkel måte for å kartlegge antistoffbindingsregion, men letter også aminosyre (aa) mutagenese gjennom rest skanning eller substitusjon for å evaluere bindingsinteraksjonen mellom hver aa rest av epitopen peptidet og CDR'ene i antistoffet.

<p class = "jove_content"> Her, beskriver den foreliggende studien en protokoll for effektiv identifikasjon av den lineære epitop av gule havabbor nervøs nekrose virus (YGNNV) kappeproteinet ved hjelp av en nøytraliserende mAb ^{to, tre, fire.} Protokollen omfatter mAb forberedelse, konstruksjon og ekspresjon av serielt trunkerte rekombinante proteiner, syntetiske overlappende peptid utforming, dot-blot-hybridisering, alanin-skanning, og substitusjon mutagenese. Tatt i betraktning den høye kostnaden for peptid-syntese, ble det trinn å serielt å avkorte de rekombinante proteiner fra et ønsket mål-protein modifiseres, og det antigeniske region ble redusert til rundt 100 til 200 aa rester før det syntetiske peptid matrisen dot-blot-analyse ble utført.

Protocol

1. Fremstilling av monoklonalt antistoff Kultur RG-M56 musmonoklonale hybridomceller 2 i serumfritt medium i 175T kolber ved 37 ºC med 5% CO 2 supplement. Samle supernatanten når fargen av mediet blir gul etter fem dagers inkubasjon. MERK: Hybridomceller ble dyrket i serumfritt medium for å unngå forurensning antistoff fra føtalt bovint serum. Sentrifuger supernatanten ved 4500 xg i 30 min ved 4 ° C og kast celleavfall pellet. Tilsett 2 ml pr…

Representative Results

Målet med dette forsøket var å identifisere en epitop gjennom dot blotting ved hjelp av mAb. Til hurtig og effektivt begrense det antigene området gjenkjent av mAb, ble full-lengde og avkortede serielt YGNNV rekombinante kappeproteiner med en 6xHis fusjon kode ved C-terminus uttrykt fra en E. coli-ekspresjonssystem PET 10 (figur 1A). De resulterende rekombinante proteiner ble flekket ut på PVDF-membran ved hjelp av RG-M56 mAb og anti…

Discussion

Denne protokollen gir en hurtig og enkel teknikk for å identifisere en mAb-gjenkjent lineær epitop. Tatt i betraktning kostnadene for peptidsyntese og produksjonseffektivitet til å syntetisere peptider, ble den antigene region av viruskappeproteinet redusert ved å uttrykke i serie trunkerte rekombinante proteiner før peptidet scanning-analyse. Som sådan, er en pålitelig og effektiv E. coli pET-ekspresjonssystemet anvendt for å fremstille disse serielt trunkerte rekombinante proteiner som rekombinante pr…

Materials

Hybrid-SFM medium	Gibco	12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0502	Including buffers
T4 DNA Ligase	Roche	10799009001	Including buffers
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Including buffers
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Including buffers
pET-20b(+) vector	Novagen, Merck Millipore	69739
E.coli DH-5α competent cell	RBC Bioscience	RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell	RBC Bioscience	RH217
Ampicillin	Amresco	0339-25G
LB broth	Invitrongen	12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Methanol	Merck Millipore	106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Glycine	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glycerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody	Jackson ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Image System	UVP	n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8	UVP	n/a
MyCycler thermal cycler	BioRad	1709713