Peptid Scanning-assisterad Identifiering av en monoklonal antikropp-erkända Linear B-cell-epitop
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
Identifieringen av en antigenepitop av immunsystemet gör det möjligt för förståelsen av skyddsmekanism av neutraliserande antikroppar som kan underlätta utvecklingen av vacciner och peptidläkemedel. Peptid scanning är en enkel och effektiv metod att rättframt kartor den linjära epitop som igenkännes av en monoklonal antikropp (mAb). Här presenterar författarna en epitop bestämningsmetod som involverar serie stympade rekombinanta proteiner, syntetisk peptid design och dot-blot-hybridisering för antigen erkännande av nervös necrosis virus coat protein med användning av en neutraliserande mAb. Denna teknik förlitar sig på dot-blot-hybridisering av syntetiska peptider och mAbs på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den minsta antigena regionen av ett viralt höljeprotein som känns igen av den RG-M56 mAb kan inskränkas för steg-för-steg trimmas peptidkartläggning på en 6-mer-peptid-epitopen. Dessutom, mutagenes och återstoden alaninscanning subkonstitution kan utföras för att karaktärisera bindningen betydelsen av varje aminosyrarest som utgör epitopen. Resterna flankerar epitopen platsen konstaterades att spela kritiska roller i peptidkonforma reglering. Den identifierade epitopen peptiden kan användas för att bilda kristaller av epitoppeptiden-antikroppskomplex för en röntgendiffraktion studien och funktionell konkurrens, eller för terapeutika.
Introduction
I immunsystemet, tillåter rekombinationen av V-, D-, och J-segment för antikroppar för att skapa enorma variationer av komplementaritetsbestämmande regioner (CDR) för bindning till olika antigener för att skydda värden från patogen infektion. Den neutraliserande försvar av antikroppar mot antigener beror på den rumsliga komplementaritet mellan de CDR av antikropparna och de epitoper av antigenerna. Därför kommer en förståelse av denna molekylär interaktion hjälpa profylaktiskt vaccin design och terapeutiska peptiden läkemedelsutveckling. Emellertid kan denna neutralisation växelverkan påverkas både genom multipla antigena domäner från en enda antigen och genom multipla CDRs av antikroppar, vilket följaktligen gör epitopen bestämningsprocessen mer komplex. Lyckligtvis möjliggör en ständigt dividera sats av celler till sek utveckling av hybridom-teknik, som säkringar individuella antikroppsproducerande celler med myelomceller,rete en specifik antikropp, känd som en monoklonal antikropp (mAb) 1. Hybridomceller producerar dessa rena, med hög affinitet mAbs att binda till ett enda antigent domänen av ett specifikt antigen. I förhållandet mellan antigen-antikropps etablerad, flera tillvägagångssätt, inklusive peptid skanning, kan användas för att bestämma epitopen av ett antigen med användning av dess motsvarande mAb. Den senaste utvecklingen inom syntetisk peptid teknik har gjort peptid scanning tekniken mer tillgänglig och enklare att utföra. I korthet är en uppsättning av överlappande syntetiska peptider som framställts i enlighet med en målantigen-sekvens och är associerade till en fast-uppburen membran för mAb hybridisering. Peptid scanning erbjuder inte bara ett enkelt sätt att kartlägga den antikroppsbindande regionen, utan underlättar också aminosyra (aa) mutagenes genom rest scanning eller substitution för att utvärdera bindningsväxelverkan mellan varje aa rest av epitopen peptiden och CDR av antikroppen.
<p class = "jove_content"> Här beskriver föreliggande studie ett protokoll för effektiv identifiering av den linjära epitopen av den gula grouper nervösa necrosis virus (YGNNV) höljesprotein med användning av en neutraliserande mAb 2, 3, 4. Protokollet innehåller mAb förberedelse, konstruktion och uttryck av serie stympade rekombinanta proteiner, syntetiska överlappande peptid design, dot-blot-hybridisering, alaninavsökning och substitutionsmutagenes. Med tanke på de höga kostnaderna för peptidsyntes, var steget att seriellt trunkera de rekombinanta proteiner av ett önskat målprotein modifieras och den antigena regionen minskat ner till omkring 100 till 200 aa-rester innan den syntetiska peptiden array dot-blot-analys utfördes.Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en snabb och enkel teknik för att identifiera en mAb erkända linjär epitop. Med hänsyn till kostnaden för peptidsyntes och produktionseffektiviteten för syntetisera peptider, var den antigena regionen av virushöljeproteinet reduceras genom att uttrycka seriellt stympade rekombinanta proteiner före peptidavsökningsanalys. Som sådan var den pålitliga och effektiva E.coli pET-expressionssystem som används för att producera dessa seriellt stympade rekombinanta proteiner, såsom reko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
