En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer
Summary
Ici, nous décrivons la configuration, la navigation logicielle, et l' analyse de données pour une méthode spatiale et temporelle précise de la mesure tonique et les changements de glutamate extracellulaire phasiques in vivo en utilisant des réseaux de microélectrodes enzyme-linked (MEA).
Abstract
perturbation neurotransmetteur est souvent un élément clé des maladies du système nerveux central (SNC), jouant un rôle dans la pathologie sous-jacente de la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression et l'anxiété. Traditionnellement, microdialyse a été le plus commun (louangé) technique pour examiner les changements de neurotransmetteurs qui se produisent dans ces troubles. Mais parce que microdialyse a la capacité de mesurer les changements lents 1-20 minute dans de vastes zones de tissu, il présente l'inconvénient d'invasivité, risque de détruire les connexions intrinsèques dans le cerveau et une capacité d'échantillonnage lente. Une technique relativement récente, la matrice de microélectrodes (MEA), présente de nombreux avantages pour la mesure des changements de neurotransmetteurs spécifiques au sein des régions discrètes du cerveau comme ils se produisent, ce qui rend une approche spatiale et temporelle précise. En outre, en utilisant les AME est peu invasive, permettant la mesure des modifications de neurotransmetteurs in vivo. Dans notre laboratoire, nous have été particulièrement intéressés par des changements dans le neurotransmetteur, le glutamate, lié à la pathologie de la maladie d'Alzheimer. En tant que tel, la méthode décrite ici a été utilisé pour évaluer les perturbations potentielles hippocampiques en glutamate dans un modèle de souris transgénique de la maladie d'Alzheimer. En bref, le procédé utilisé consiste à enduire une microélectrode multi-site avec une enzyme très sélective pour le neurotransmetteur d'intérêt et l'utilisation de sites d'auto-référencement pour soustraire le bruit de fond et les interférents. Après étalement et d'étalonnage, on peut construire la MEA avec une micropipette et abaissé dans la région du cerveau d'intérêt à l'aide d'un appareil stéréotaxique. Ici, le procédé décrit consiste à anesthésier RTG (TauP301L) 4510 souris et en utilisant un appareil stéréotaxique afin de cibler avec précision les sous-régions (DG, CA1 et CA3) de l'hippocampe.
Introduction
La mesure des modifications de neurotransmetteurs dans le cerveau est un outil essentiel pour l'étude des maladies neuroscientifiques du système nerveux central (SNC) qui sont souvent caractérisées par la dérégulation des neurotransmetteurs. Bien que microdialyse en combinaison avec une Chromatographie liquide haute pression (HPLC / CE) est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires 1, 2, 3, 4, la résolution spatiale et temporelle des sondes de microdialyse peuvent ne pas être idéal pour les neurotransmetteurs , tel que le glutamate, qui sont étroitement régulée dans l'espace extracellulaire 5, 6. En raison des progrès récents de la génétique et de l' imagerie, il existe d' autres méthodes qui peuvent être utilisées pour cartographier le glutamate in vivo. Utilisation reporters fluorescents glutamate génétiquement codés (iGluSnFR) und ' imagerie à deux photons, les chercheurs sont capables de visualiser la libération de glutamate par les neurones et les astrocytes in vitro et in vivo 7, 8, 9. En particulier, cela permet d'enregistrer à partir d'un champ de vision plus large et ne perturbe pas les connexions intrinsèques du cerveau. Bien que ces nouvelles techniques optiques permettent la visualisation de la cinétique du glutamate et mesure des réponses sensorielles et de l'activité neuronale évoqués, ils ne sont pas capables de quantifier la quantité de glutamate dans l'espace extracellulaire dans les régions discrètes du cerveau.
Une autre méthode est la matrice de microélectrodes (MEA) lié à une enzyme qui permet de mesurer de manière sélective les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire, tels que le glutamate, par l'utilisation d'un système d'enregistrement auto-référencée. La technique de MEA a été utilisée pour étudier les modifications dans le glutamate extracellulaire après cérébrales traumatiquesblessure 10, 11, 12, vieillissement de 13, 14, le stress 15, 16, l' épilepsie 17, 18, la maladie d'Alzheimer 19, 20, et l' injection d'un synoptique viral 21 et représente une amélioration par rapport aux limites spatiales et temporelles inhérentes à la microdialyse. Alors que microdialyse limite la capacité à mesurer près de la synapse 22, 23, AME ont une haute résolution spatiale qui permet des mesures sélectives de glutamate extracellulaire empiétement synapses près de 24, 25. En second lieu, la faible résolution temporelle de microdialyse (1 – 20 min) limite la possibilité d'étudier ladynamique rapide de la libération et la clairance du glutamate qui se produisent dans la milliseconde à la deuxième plage 26. En raison des différences dans la libération ou la clairance du glutamate peuvent ne pas être évident dans les mesures de tonique, de repos taux de glutamate, il peut être essentiel que mesurer directement la libération et la clairance du glutamate. AME permettent de telles mesures en raison de leur haute résolution temporelle (2 Hz) et faibles limites de détection (<1 um). En troisième lieu, les AEM permettent l'examen des variations sous-régionales dans les neurotransmetteurs dans une région particulière du cerveau, telles que l'hippocampe de rat ou de la souris. Par exemple, en utilisant AME on peut cibler séparément le gyrus denté (DG), corne d' Ammon 3 (CA3) et corne d' Ammon 1 (CA1) de l'hippocampe, qui sont reliés par l' intermédiaire d' un circuit trisynaptic 27, pour examiner les différences sous – régionaux de glutamate extracellulaire. En raison de la taille des sondes de microdialyse (1 – longueur de 4 mm) et les dommages causés par l' implantation 28 </ sup>, 29, les différences sous – régionales sont difficiles à traiter. En outre, les systèmes optiques ne permettent la stimulation par des stimuli externes, comme une stimulation ou quartiles le scintillement de lumière, ce qui ne permet pas la stimulation sous – régionale 7. Un dernier avantage des AME par rapport aux autres méthodes est la possibilité d'étudier ces sous – régions in vivo sans perturber leurs relations extrinsèques et intrinsèques.
Ici, nous décrivons comment un système d'enregistrement (par exemple, FAST16mkIII) en combinaison avec les AEM, consistant en une microélectrode multisite à base de céramique, peut être revêtue de façon différentielle sur les sites d'enregistrement pour permettre à des agents interférant être détectés et supprimés à partir du signal d'analyte. Nous démontrons également ces tableaux peuvent être utilisés pour des études à base ampérométrie-de régulation du glutamate in vivo au sein de la DG, CA3 et sous – régions hippocampiques CA1 de ELO anesthésié (TauP301L) 4510 souris, un couramment utilisé mmodèle Ouse de la maladie d'Alzheimer. De plus, nous confirmons que la sensibilité du système de MEA à la dynamique rapide de la libération du glutamate et la clairance en traitant les souris avec riluzole, un médicament montré in vitro pour diminuer la libération du glutamate et d' augmenter l' absorption du glutamate 30, 31, 32, 33, et de démontrer ces changements respectifs in vivo dans le modèle de souris TauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique de MEA permet de mesurer la cinétique rapide de la libération et l' absorption neurotransmetteur in vitro et in vivo. Par conséquent, la technologie produit une grande variété de la production de données, y compris les niveaux de neurotransmetteurs tonique, la libération des neurotransmetteurs évoqué, et la clairance des neurotransmetteurs. Cependant, parce que l'utilisation des AME est une procédure relativement complexe, il existe de nombreux facteurs qui peuvent avoir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Institut national des sciences médicales générales (MRN, U54GM104942), NIA (MRN, R15AG045812), l'Association Alzheimer (MRN, NIRG-12-242187), WVU Faculté Sénat Subvention de recherche (MRN), et WVU PSCOR Grant (MRN).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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