El uso de biosensores basados en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer
Summary
A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).
Abstract
alteración de neurotransmisores es a menudo un componente clave de las enfermedades del sistema nervioso central (SNC), que juega un papel en la patología subyacente de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la depresión y la ansiedad. Tradicionalmente, microdiálisis ha sido la técnica más común (alabado) para examinar los cambios de neurotransmisores que se producen en estos trastornos. Pero debido a microdiálisis tiene la capacidad de medir cambios lentos 1-20 minutos a través de grandes áreas de tejido, tiene la desventaja de invasividad, potencialmente destruyendo conexiones intrínsecas dentro del cerebro y una capacidad de muestreo lento. Una técnica relativamente nueva, la matriz de microelectrodos (MEA), tiene numerosas ventajas para la medición de cambios de neurotransmisores específicos dentro de las regiones discretas del cerebro que se producen, lo que para un enfoque espacial y temporalmente precisa. Además, utilizando los AMA es mínimamente invasiva, permitiendo para la medición de las alteraciones de neurotransmisores en vivo. En nuestro laboratorio, HÅHe sido específicamente interesados en los cambios en el neurotransmisor, glutamato, relacionado con la patología de la enfermedad de Alzheimer. Como tal, el método descrito aquí se ha utilizado para evaluar posibles perturbaciones del hipocampo en glutamato en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer. Brevemente, el método utilizado consiste en el recubrimiento de un microelectrodo multi-sitio con una enzima muy selectivo para el neurotransmisor de interés y el uso de sitios de autorreferencia para restar el ruido y los interferentes de fondo. Después de sembrar y de calibración, el MEA puede ser construido con una micropipeta y se baja en la región del cerebro de interés utilizando un dispositivo estereotáxico. Aquí, el método descrito implica anestesiar RTG (TauP301L) 4510 ratones y el uso de un dispositivo estereotáxico para orientar con precisión sub-regiones (DG, CA1 y CA3) del hipocampo.
Introduction
La medición de las alteraciones de neurotransmisores en el cerebro es una herramienta esencial para los neurocientíficos que estudian las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) que a menudo se caracteriza por la desregulación del neurotransmisor. Aunque microdiálisis en combinación con cromatografía líquida de alta presión (HPLC / CE) ha sido el método más ampliamente utilizado para medir cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares 1, 2, 3, 4, la resolución espacial y temporal de las sondas de microdiálisis puede no ser ideal para los neurotransmisores , tales como glutamato, que están estrechamente regulada en el espacio extracelular 5, 6. Debido a los recientes avances en la genética y la formación de imágenes, hay métodos adicionales que se pueden utilizar para mapear glutamato in vivo. Uso de reporteros fluorescentes glutamato codificados genéticamente (iGluSnFR) unad de dos fotones de formación de imágenes, los investigadores son capaces de visualizar la liberación de glutamato por las neuronas y astrocitos tanto in vitro como in vivo 7, 8, 9. En particular, esto permite la grabación de un campo de visión más amplio y no interrumpe las conexiones intrínsecas del cerebro. Aunque estas nuevas técnicas ópticas permiten la visualización de la cinética de glutamato y la medición de respuestas evocadas sensoriales y la actividad neuronal, que carecen de la capacidad de cuantificar la cantidad de glutamato en el espacio extracelular en regiones discretas del cerebro.
Un método alternativo es la matriz de microelectrodos ligado a enzimas (MEA) que puede medir selectivamente niveles de neurotransmisores extracelulares, tales como el glutamato, a través del uso de un esquema de registro por sí mismo se hace referencia. La técnica MEA se ha utilizado para estudiar las alteraciones en el glutamato extracelular siguientes cerebral traumáticalesión 10, 11, 12, el envejecimiento 13, 14, la tensión 15, 16, epilepsia 17, 18, enfermedad de Alzheimer 19, 20, y la inyección de un viral imitador 21 y representa una mejora sobre las limitaciones espaciales y temporales inherentes a microdiálisis. Mientras que microdiálisis restringe la capacidad de medir cerca de la sinapsis 22, 23, AAM tienen una alta resolución espacial que permite medidas selectivas de desbordamiento de glutamato extracelular cerca de sinapsis 24, 25. En segundo lugar, la resolución temporal baja de microdiálisis (1 – 20 min) limita la capacidad para investigar ladinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento que se producen en la milésima de segundo a segundo rango 26. Debido a las diferencias en la liberación o el aclaramiento de glutamato pueden no ser evidentes en las medidas de tónico, descansando los niveles de glutamato, puede ser esencial que la liberación de glutamato y el aclaramiento medirse directamente. MEAs permiten para tales medidas debido a su alta resolución temporal (2 Hz) y bajos límites de detección (<1 m). En tercer lugar, los AMA permiten examen de las modificaciones subregionales de neurotransmisores dentro de una región particular del cerebro, tales como el hipocampo de rata o de ratón. Por ejemplo, usando MEAs podemos dirigir por separado el giro dentado (DG), Cornu ammonis 3 (CA3) y Cornu ammonis 1 (CA1) del hipocampo, que están conectados a través de un circuito de trisynaptic 27, para examinar las diferencias subregionales en glutamato extracelular. Debido al tamaño de las sondas de microdiálisis (1 – 4 mm de longitud) y los daños causados por la implantación 28 </ sup>, 29, las diferencias subregionales son difíciles de tratar. Además, los sistemas ópticos sólo permiten la estimulación a través de estímulos externos, tales como una estimulación de la barba o parpadeo de la luz, que no permite la estimulación subregional 7. Un beneficio final de los AMA sobre otros métodos es la capacidad para estudiar estas subregiones in vivo sin interrumpir sus conexiones extrínsecos e intrínsecos.
A continuación, describimos cómo un sistema de grabación (por ejemplo, FAST16mkIII) en combinación con AAM, que consta de un microelectrodo de múltiples sitios a base de cerámica, se puede recubrir de forma diferencial en los sitios de registro para permitir a los agentes de interferencia para ser detectado y eliminado de la señal de analito. También demostramos estas matrices se pueden utilizar para los estudios basados en Amperometry de regulación de glutamato in vivo dentro de la DG, CA3, CA1 del hipocampo y subregiones de anestesiado RTG (TauP301L) 4510 ratones, un m comúnmente utilizadoouse modelo de la enfermedad de Alzheimer. Además, proporcionamos confirmación de la sensibilidad del sistema de MEA a la dinámica rápida de la liberación de glutamato y el aclaramiento mediante el tratamiento de los ratones con riluzol, un fármaco se muestra in vitro para disminuir la liberación de glutamato y aumentar la captación de glutamato 30, 31, 32, 33, y la demostración de estos respectivos cambios en vivo en el modelo de ratón TauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica MEA permite la medición de la cinética rápida de la liberación de neurotransmisores y la absorción in vitro e in vivo. Por lo tanto, la tecnología produce una amplia variedad de salida de datos incluyendo los niveles de neurotransmisores tónicas, la liberación de neurotransmisores evocada, y el aclaramiento del neurotransmisor. Sin embargo, ya que el uso de los AMA es un procedimiento relativamente complejo, existen numerosos factores que pueden necesitar ser optimizado para el uso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Asociación de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Facultad de Investigación del Senado Grant (MNR), y WVU PSCOR Subvención (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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