Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד במדויק הכדאיות העצבית באמצעות fluorescein diacetate (FDA) ו Propidium Iodide (PI) מכתים פעמיים בתרבית נוירונים גרגר cerebellar, התרבות העצבית הראשית המשמשת במודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ומחקר neuropharmacology.

Abstract

ראשוני Cerebellar Cranbellar גרגר נוירונים (CGNs) כבר בשימוש נרחב כמודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ו neuropharmacology מחקר. עם זאת, דו קיום של תאים גליה ו נוירונים בתרבות CGN עלול להוביל biases בהערכה מדויקת של הכדאיות העצבית. פלואורסצין diacetate (FDA) ו Propidium יודיד (PI) מכתים פעמיים שימש למדוד הכדאיות התא על ידי הערכה בו זמנית של תאים קיימא ומת. השתמשנו FDA-PI מכתים כפול כדי לשפר את הרגישויות של מבחני colorimetric וכדי להעריך את הכדאיות העצבית CGNs. יתר על כן, הוספנו כתמים דנ"א כחול פלואורסצנטי ( למשל, Hoechst) כדי לשפר את הדיוק. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשפר את הדיוק של הערכה של הכדאיות העצבית באמצעות שיטות אלה בתרבות CGN. באמצעות פרוטוקול זה, מספר תאים גליה ניתן להרחיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה ניתן ליישם כדי להבחין בין gli לא רצויאל תאי נוירונים בתרביות תאים מעורבים שונים, כגון תרבות קליפת המוח הראשית ותרבות בהיפוקמפוס.

Introduction

מבחני ציטוטוקסיטי Colorimetric, כגון assay (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT), משמשים בדרך כלל למדוד כדאיות התא במבחנה . ראשוני Cerebellar מתורבת גרעינים נוירונים (CGNs) מחולדות הם רגישים נוירוטוקסים שונים, כולל יון 1-methyl-4-phenylpyridinium, מי חמצן, ו גלוטמט 1 , 2 . לכן, תרבויות CGN יכול לשמש מודל במבחנה בתחום של מדעי המוח. תרבויות CGN יכולות להכיל מגוון של תאים, כולל נוירונים ותאי גלייה, אשר יכולים להסביר כ 1% מכלל התאים בתרבית CGN. עם זאת, תאים גליה להגיב באופן שונה neurotoxins לעומת נוירונים, המוביל הטיה של הכדאיות העצבית נמדדת מבחני colorimetric 3 .

בתאים קיימא, fluorescein diacetate (FDA) ניתן להמיר פלואורסצין על ידי esterase.Propidium יודיד (PI) יכול לתקשר עם ה- DNA לאחר חודר תאים מתים והוא יכול לשמש כדי להצביע אפופטוזיס בתוך התרבות. לכן, מכתים FDA-PI כפול יכול להעריך בו זמנית תאים קיימא תאים מתים, מה שמרמז כי הכדאיות התא ניתן למדוד בצורה מדויקת יותר על ידי שילוב של שתי שיטות colorimetric. יתר על כן, על ידי הוספת Hoechst, כתם פלואורסצנטי כחול עבור גרעינים, את דיוק הכדאיות התא יכול להיות משופר עוד יותר. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר מכתים FDA-PI כפול ו- FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנתח במדויק הכדאיות העצבית CGNs מתורבת העיקרי.

פרוטוקול זה מנצל הדמיה והבחנה CGNs ותאי גלייה על ידי גדלים וצורות שונות שלהם. לאחר מכתים, את המספרים של נוירונים קיימא נוירונים מת נספרים תמונות נציג שנלקחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי הגלייה הגדולים אינם נכללים על ידי השוואה בין CGNs טיפוסיAken תחת מצב פלורסנט עם אלה שנלקחו במצב ניגודיות שלב. אסטרטגיה דומה ניתן לבצע כדי למדוד הכדאיות העצבית בתרביות תאים מעורבים המכילים נוירונים ותאי גלייה, כגון תרבויות קליפת המוח היסודי ותרבויות בהיפוקמפוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים בעקבות המכון הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסומים NIH מס '80-23, מתוקן 1996) ו אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) ב אוניברסיטת Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. הכנת פתרונות מדיה ותרבות

הערה: ריאגנטים ומלאי צריך להיות מוכן בתנאים סטריליים. לעקר על ידי סינון באמצעות מסנן עם גודל הנקבוביות של 0.22 מיקרומטר.

  1. הכן פולי L-Lysine (PLL) פתרון המניות על ידי הוספת 5 מ"ג של PLL ל 10 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O). לעקר על ידי סינון. Aliquot ולאחסן את פתרון המניות PLL ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  2. הכנת חיידקים קרבס על ידי הוספת 7.25 גרם של NaCl, 0.4 גרם של KCl, 0.14 גרם של NaH 2 PO 4 , 2.6 גרם של גלוקוז D, ו 5.94 גרם של 4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה ל 100 מ"ל של DdH 2 </ Sub> O. לעקר על ידי סינון. חנות הפתרון חיץ קרבס ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
  3. הכן 3.82% Mg 2 SO 4 פתרון על ידי הוספת 3.82 גרם של MG 2 SO 4 ל 100 מ"ל של DDH 2 O. לעקר על ידי סינון. חנות MG 2 SO 4 פתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  4. הכן 1.2% CaCl 2 פתרון על ידי הוספת 1.2 גרם של CaCl 2 ל 100 מ"ל של DDH 2 O. לעקר על ידי סינון. חנות הפתרון CaCl 2 ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  5. הכן 2M פתרון KCl על ידי הוספת 15 גרם של KCl ל 100 מ"ל של DDH 2 O. לעקר על ידי סינון. חנות הפתרון KCl ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  6. הכן את פתרון המניות גלוקוז D ידי הוספת 1.8 גרם של גלוקוז D ל 100 מ"ל של DDH 2 O. לעקר על ידי סינון. Aliquot ולאחסן את הפתרון גלוקוז D ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש.
  7. הכנת ציטוזין β-D-Arabinofuranoside (ער"א) סולוט המניותיון על ידי הוספת 0.24 גרם של Ara-C ל 10 מ"ל של DDH 2 O. לעקר על ידי סינון. Aliquot ולאחסן את פתרון המניות Ara-C ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  8. הכן 250 מ"ל של המדיום תרבות (עבור 25-30 גורים) באמצעות 25 מ"ל של סרום עוברי שורש (FBS), 2.5 מ"ל של גלוטמין 100x, 2.78 מ"ל של פתרון KCl 2M, ו 2.5 מ"ל של אנטיביוטיקה 100x בסל בינוני הנשר (BME) . התאם את עוצמת הקול ל 250 מ"ל לעקר על ידי סינון.
  9. הכן 25K בינוני באמצעות 2.5 מ"ל של גלוטמין 100x, 2.78 מ"ל של פתרון KCl 2M, ו 2.5 מ"ל של אנטיביוטיקה 100x ב BME. התאם את עוצמת הקול ל 250 מ"ל לעקר על ידי סינון.
  10. הכן 5K בינוני באמצעות 2.5 מ"ל של גלוטמין 100x ו 2.5 מ"ל של אנטיביוטיקה 100X ב BME. התאם את עוצמת הקול ל 250 מ"ל לעקר על ידי סינון.
    הערה: בינוני המדיום, בינוני 25K, ו 5K בינוני צריך להיות מוכן טרי
  11. הכן פתרון ה- FDA המניות על ידי הוספת 5 מ"ג של ה- FDA ל 1 מ"ל של אצטון. אחסן את פתרון המלאי של ה- FDA ב- 4 ° C לאחסון לטווח ארוך/ Li>
  12. הכן פתרון המניות PI על ידי הוספת 1 מ"ג של PI ל 1 מ"ל של dDH 2 O. לאחסן את הפתרון מניות PI ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  13. הכן Hoechst פתרון המניות על ידי הוספת 5 מ"ג של Hoechst 33342 ל 1 מ"ל של DDH 2 O. לאחסן את פתרון המניות Hoechst ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.

2. הכנת פתרונות Dissection

הערה: האם זה 1 ד לפני הניתוח.

  1. הכן את הפתרון לנתיחה על ידי הוספת 15 מ"ל של חיץ קרבס, 1.2 מ"ל של 3.82% Mg 2 SO 4 פתרון, ו 0.45 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA) ל 150 מ"ל של DDH 2 O. להתאים את ה- pH 7.4 באמצעות NaOH.
  2. תווית 5 x 50 מ"ל צינורות כדלקמן: 1, 2, 3, 4, ו 5.
  3. מקום 40 מ"ל של פתרון לנתיחה לתוך מזרק 50 מ"ל עם מסנן. מסנן 30 מ"ל של פתרון לנתיחה לתוך צינור 1, ו 2 מ"ל כל כמה 35 מ"מ מנות תרבות התא, אשר ישמשו לעבד רקמות.
  4. כדי לא2, להוסיף 12.5 מ"ג טריפסין ב 50 מ"ל של פתרון לנתיחה. מערבבים לחלוטין על ידי vortexing. לעקר על ידי סינון.
  5. כדי צינור 3, להוסיף 1.2 מ"ג של DNAse I, 7.8 מ"ג של מעכב טריפסין סויה, ו 150 μL של 3.82% Mg 2 SO 4 פתרון ב 15 מ"ל של פתרון לנתיחה. מערבבים לחלוטין על ידי vortexing. לעקר על ידי סינון.
  6. כדי צינור 4, להוסיף 5 מ"ל של הפתרון מצינור 3. הוסף 10.5 מ"ל של פתרון לנתיחה. לעקר על ידי סינון.
  7. כדי צינור 5, להוסיף 100 μL של 3.82% Mg 2 SO 4 פתרון ו 15 μL של פתרון CaCl 2 % 1.2 ב 12.5 מ"ל של פתרון לנתיחה. מערבבים לחלוטין על ידי vortexing. לעקר על ידי סינון.
  8. חנות כל הצינורות על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. ציפוי צלחות תרבות תאים

הערה: האם זה 1 ד לפני הניתוח.

  1. הוסף 1 מ"ל של פתרון מלאי PLL ל 100 מ"ל של DDH 2 O (הריכוז הסופי: 5 מיקרוגרם / מ"ל). מעיל פלסטיק6-היטב או 12 גם צלחות תרבות התא (2 מ"ל לכל היטב עבור 6 גם צלחות תרבות התא או 1 מ"ל לכל טוב 12 צלחות תרבות תאים) על ידי הוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של תמיסת פולי- L- ליזין.
  2. דגירה בטמפרטורת החדר למשך יום 1 (או ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות). 1-2 שעות לפני הניתוח, להסיר את הפתרון באמצעות פיפטה. לשטוף פעם אחת עם DDH 2 O ויבש ברדס תרבות התא.

4. עיבוד רקמות עבור חולדות בן 8 ימים Sprague-Dawley.

  1. שים צלחת 100 מ"מ על הקרח. לערוף את הגורים חולדה לתוך צלחת באמצעות זוג מספריים מעוקרים.
  2. הכנס את המספריים לתוך magnum foramen וחותכים את שני הצדדים של הגולגולת, מן האוזניים אל העיניים. הרם את הגולגולת באמצעות זוג מלקחיים. ודא שכל המוח נמצא בתוך הגולגולת. לבודד את המוח הקטן והכניסו אותו לתוך צלחת 35 מ"מ לעיל באמצעות זוג מלקחיים.
  3. עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח. הסר את קרום המוח ואת כלי הדם עם שני זוגות מלקחיים.
  4. קוצצים את הרקמות עם להב. שים את הרקמות לתוך צינור 1. צנטריפוגה 5 דקות ב RT ו 1500 x גרם.
  5. לשאוב את supernatant. שמור את גלולה.
  6. מוסיפים את הפתרון בצינור 2 ל גלולה. Resuspend על ידי רעד בעדינות.
  7. מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בעדינות לנער כל 3 דקות.
  8. הוסף את הפתרון בצינור 4 לפתרון זה. לנער צנטריפוגה 5 דקות ב RT ו 1500 x גרם.
  9. לשאוב את supernatant. שמור את גלולה.
  10. מוסיפים את הפתרון בצינור 3 כדי resuspend גלולה.
  11. הכן שתי צינורות 15 מ"ל. מקום חצי של תאים בכל צינור. פיפטה למעלה ולמטה 60-70x באמצעות פיפטה פסטר מחובר פקנת כדי homogenize התאים.
  12. הוסף 3 מ"ל של הפתרון בצינור 5 לכל צינור 15 מ"ל. תן להם לשבת RT למשך 10 דקות ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant עם פיפטה פסטר מחובר פקנת. מניחים את supernatant לתוך צינורות חדשים 15 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב RT ו 1500 x גרם.
  13. אלסובב את supernatant. שמור את גלולה.
  14. הוסף בינוני תרבות לתוך גלולה כדי לקבל צפיפות התא של סביב 1.5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​(כ 100 מ"ל עבור 10 גורים).
  15. שים את התאים לתוך צלחות תרבות ותרבות אותם באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2 .

תוספת של ערמה C ו- D גלוקוז במהלך התרבות

  1. לאחר 24 שעות, להוסיף פתרון המניות ערה- C (10 μL / גם עבור 12 גם צלחות תרבות התא או 20 μL / גם עבור 6-טוב גם צלחות תרבות התא, הריכוז הסופי: 1 מ"מ) כדי לעכב את הצמיחה של התאים גליה.
  2. ביום 7, להוסיף 50 μL של D- גלוקוז פתרון המניות לכל טוב עבור 12 גם צלחות תרבות תאים או 100 μL לכל טוב עבור 6 גם צלחות תרבות התא כך ריכוז סופי הוא 1 מ"מ.

6. FDA-PI מכתים כפולה ו- FDA-PI-Hoechst טריפל מכתים בתרבות CGN

  1. הכן FDA-PI פתרון עובד על ידי הוספת 20 μL של פתרון ה- FDA המניות (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל) ו 50 μL של פתרון מניות PI (ריכוז סופי: 50 מיקרוגרם / מ"ל) ב 10 מ"ל של PBS. מערבבים על ידי vortexing ומניחים על הקרח.
    1. עבור ה- FDA-PI-Hoechst פתרון עובד, להוסיף 20 μL של פתרון ה- FDA המניות (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל), 50 μL של פתרון מניות PI (ריכוז סופי: 50 מיקרוגרם / מ"ל), ו 10 μL של Hoechst פתרון המניות (ריכוז סופי: 5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 10 מ"ל של PBS. מערבבים על ידי vortexing ומניחים על הקרח.
      הערה: הכן מחדש את פתרון ה- FDA-PI טריים ופתרון העבודה של ה- FDA-PI-Hoechst ממש לפני השימוש.
  2. קח את הצלחת תרבות התא מתוך חממה. שים את זה על הקרח.
  3. לשאוב את המדיום התרבות ולהחליף אותו עם PBS קר.
    הערה: שינוי הפתרון צריך להיעשות לאט ובזהירות. הימנע לגעת בתאים עם טיפים פיפטה.
  4. לשאוב את PBS קר ולהחליף אותו עם קר ה- FDA-PI או FDA-PI-Hoechst פתרון עובד (500 μL / אנחנוLl עבור 12 גם צלחות תרבות התא או 1 מ"ל / גם עבור 6-היטב תאים תרבות התא). השאירו על הקרח במשך 5 דקות.
  5. לשאוב את ה- FDA-PI או FDA-PI-Hoechst פתרון עבודה ולהוסיף PBS קר (100 μL / גם עבור 12 גם צלחות תרבות תאים או 50 μL / גם עבור 6-גם תאים תרבות תאים).
    הערה: אין לאפשר לתא להתייבש בעת צילום תמונות.
  6. קח תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש מסנן עירור עם להקה לעבור של 450 - 490 ננומטר. זיהוי פליטת הקרינה עבור ה- FDA, PI, ו Hoechst ב 520, 620, ו 460 ננומטר, בהתאמה. תחת אותם תנאים, לקחת תמונה תחת אור רגיל באמצעות מצב בניגוד שלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: לצלם תמונות בתוך 15 דקות לאחר FDA-PI או FDA-PI-Hoechst מכתים. זמן החשיפה הוא 100-300 ms והרווח האנלוגי הוא 2.8x.

7. הערכת הכדאיות העצבית

  1. עבור מכתים FDA-PI כפול, כיסוי תמונות של תאים זוהה לאחר סינוןעל ידי מסננים פלואורסצנטי שונים על ידי גרירת שכבת ה- FDA חיובי על שכבת PI חיובי בתוכנה עורך גרפיקה.
    1. התאם את אטימות שכבת ה- FDA חיובי על ידי הזנת "50%" בשדה "אטימות" של "שכבות" פאנל. מזג שתי שכבות על ידי לחיצה על הלחצן "מזג גלוי" בתפריט "שכבה". הגדר את הניגוד של תמונות שכבת על ידי הזנת "50" בשדה "ניגוד" תחת "תמונה" | "התאמות" | "ניגוד בהירות." ודא כי אין FDA ו- PI תא חיובי פעמיים בתמונות כיסוי.
  2. עבור FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת, כיסוי תמונות של תאים זוהה לאחר סינון מסננים הקרינה שונים על ידי גרירת שכבת ה- FDA חיובי על שכבת PI חיובי בתוכנה עורך גרפיקה. להתאים את אטימות של שכבת ה- FDA חיובי על ידי הזנת "50%" בשדה "אטימות" של "שכבות & #34; לוּחַ.
    1. מזג שתי שכבות על ידי לחיצה על הלחצן "מזג גלוי" בתפריט "שכבה". גרור את שכבת Hoechst חיובי על השכבה הממוזגת. כוונן את האטימות של השכבה החיובית Hoechst על ידי הזנת "50%" בשדה "אטימות" בחלונית "שכבות". למזג את שתי השכבות על ידי לחיצה על כפתור "מיזוג גלוי" בתפריט "שכבה".
  3. מבחינה ויזואלית להבחין בתאי גלייה גדולים לא סדירים מ CGNs על ידי השוואת התמונות שצולמו תחת מצב פלורסנט עם אלה שנלקחו במצב ניגוד שלב - תאים עם קוטר גדול פי שלושה יותר CGNs נחשבים תאים גליה צריך להיות נשלל.
  4. ספירת מספר נוירונים קיימא נוירונים מתים, בהתאמה, באמצעות תוסף מונה תא בתמונה עיבוד תמונה ( למשל, ImageJ) 4 .
    1. עבור מכתים FDA-PI כפול, ידנית לסמן תאים קטנים FDA חיובי כמונוירונים קיימא. סמן באופן ידני תאים PI חיובי כמו נוירונים מתים. עבור FDA-PI-Hoechst מכתים משולשים, ידנית סימן קטן FDA ו- Hoechst כפול תאים חיוביים כמו נוירונים קיימא. סמן באופן ידני תאים PI ו- Hoechst-double-חיובי כתאי נוירונים מתים.
  5. לחשב את אחוז הכדאיות העצבית באמצעות המשוואה הבאה:% של הכדאיות העצבית = [מספר נוירונים קיימא / (מספר נוירונים מתים + מספר נוירונים קיימא)] x 100%. עבור כל טוב, לבחור חמישה שדות אקראיים הממוצע אחוז הכדאיות העצבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימונוסטטינג כפול של GAP43 (אדום) ו- GFAP (ירוק) שימש כדי לנתח את הצורה של נוירונים ותאי גלייה, בהתאמה 2 , 5 . שני נוירונים ותאי גלייה נמצאים בתרבות CGN. התאים גליה חיובי GFAP גדולים ולא סדירים בצורת, כפי שצוין על ידי החצים בתמונות ( איור 1 ). מבחני המסורתית של חיוניות התא אינו יכול להבחין בתאי גלייה נוירונים כאשר נעשה שימוש כדי למדוד הכדאיות העצבית. לכן, ה- FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים, אשר יכול להבחין בין תאים גליה נוירונים, הם יתרון להערכה מדויקת של הכדאיות העצבית בתרבות CGN.

האתגר הנמוך אשלגן שימש כדי לגרום למוות עצבי בתרבות CGN. התמונות נציג להראות את התרבות CGN לערער עם בינוני אשלגן נמוך (5K), בינוני נורמלי (25K), או origiNAL בינוני, כפי שניתח על ידי FDA PI מכתים כפול ( איור 2 א ) או FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת ( איור 2 ב ). הכדאיות העצבית הנמדדת בשיטות שונות מוצגת באיור 3 (ממוצע ± SEM). היכולות התא שנמדדו על ידי מכתים FDA-PI כפול בקבוצת הביקורת, 25K ו- 5K היו 99.8 ± 4.2%, 98.2 ± 2.9% ו -43.9% 8.6%, בהתאמה ( איור 3 א ' ). היכולות התא שנמדדו על ידי FDA-PI-Hoechst מכתים משולש בקבוצות הבקרה, 25K ו 5K היו 99.8 ± 1.6%, 96.7 ± 4.4%, ו 48.3 ± 4.4%, בהתאמה ( איור 3 ב ). התאים התא שנמדדו על ידי MTT assay בקבוצות הבקרה, 25K, ו 5K היו 102.1 ± 3.9%, 96.5 ± 1.7%, ו 57.5 ± 5.7%, בהתאמה ( איור 3 ג ). השיעורים של שחרור LDIC dehydrogenase (LDH) בקבוצות הבקרה, 25K ו- 5K היו 100.0 ± 5.5%, 94.5 ± 11.2% ו- 202.1 ± 15.3%, בהתאמה ( 2 . Assay MTT מעריך את הפעילות של NADPH תלוי oxidoreductase הסלולר, אשר משקף את מספר התאים קיימא 2 . עם זאת, שיטה זו לא הצליחה להבחין בין תאי גלייה לבין נוירונים כאשר נעשה שימוש במדידת הכדאיות העצבית בתרבית CGN. באמצעות FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים, מספר תאים גליה יכול להיות נשלל, ואת הכדאיות העצבית ניתן למדוד במדויק. יתר על כן, הכדאיות העצבית ב 5K בינוני מטופלים CGNs נמדד על ידי FDA-PI או FDA-PI-Hoechst מכתים היה מעט יותר מזה נמדד על ידי MTT assay. זה יכול להיות משום שרוב התאים הדליאלים שלא היו רגישים ל -5 K נוירוטוקסיות בינונית- Induced לא נכללו על ידי FDA-PI או FDA-PI-Hoechst מכתים, אבל לא על ידי assay MTT.

איור 1
איור 1: שני נוירונים קטנים גדולים, תאים Glial סדירה נמצאים בתרבות CGN. ביום 8 ב vitr o, CGNs היו immunostained כפול עם GAP43 (אדום) ו- GFAP (ירוק) עבור נוירונים ותאי גלייה, בהתאמה. תמונות בניגוד שלב להראות את המורפולוגיה של התאים. מבחני המסורתית של חיוניות התא אינו יכול להבחין בתאי גלייה נוירונים כאשר נעשה שימוש כדי למדוד הכדאיות העצבית. לכן, ה- FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים, אשר יכול להבחין בין תאים גליה נוירונים, הם יתרון להערכה מדויקת של הכדאיות העצבית בתרבות CGN. סולם בר: 100 מיקרומטר. חץ כחול: נוירונים טיפוסיים; חץ לבן: תאי גליה אופייניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2
FDA-PI מכתים כפולה ו- FDA-PI-Hoechst טריפל מכתים להפגין נמוך אשלגן-המושרה מוות עצבי בתרבות CGN. ביום 8 ב vitr o, תרבויות CGN הועברו ל 5K או 25K בינוני. המדיום בתרבויות הבקרה לא השתנה. לאחר 24 שעות של אתגר, תרבויות CGN היו assayed על ידי ( א ) FDA-PI מכתים כפולה או ( ב ) FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת. סולם בר = 100 מיקרומטר. חץ: תאי גליה אופייניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3: כימות של הכדאיות העצבית בתרבות CGN. ביום 8 ב vitr o, תרבויות CGN הועברו ל 5K או 25K בינוני. המדיום בתרבות הבקרהS לא השתנה. לאחר 24 שעות של אתגר, כדאיות התא נותח על ידי ( א ) FDA-PI מכתים כפול, ( ב ) FDA-PI-Hoechst מכתים משולשת, ו ( ג ) MTay assay. ( ד ) שחרור LDH נותח על ידי assay LDH. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעי ± SEM. ** p <0.01 לעומת שליטה (ANOVA, מבחן Tukey). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה שונה מ הליכים שתוארו בעבר 6 , 7 . חוקרים השקיעו זמן מנסה להפחית את התאים שאינם עצביים תאים על ידי שיפור התנאים כאשר נוירונים העיקרי culturing במבחנה 8 . עם זאת, גם עם תנאי התרבות משופרת, כמה תאים גליה להישאר. יתר על כן, תאים שאינם עצביים נחוצים תרבויות העצבית העיקרית, כי הם עוזרים עם הצמיחה העצבית התבגרות 9 . במחקר זה, Ara-C שימש כדי למזער את הצמיחה של תאים גליה, אם כי עדיין היה על נוכחות של 1 - 5% של תאים גליה בתרבות CGN. בעיה זו מוצגת גם במחקרים של קבוצות אחרות. בתרבות CGN, גדלים וצורות של תאים גליה שונים במידה ניכרת מן הנוירונים. הקוטר של CGNs הוא כ 10 מיקרומטר, ו CGNs בוגרת יש תהליכים עשירים שמחברים את הנוירונים. HoweVer, את קוטר התאים גליה בתרבות הוא גדול יחסית, על 30-100 מיקרומטר, כך קל להבחין בין תאים דליות של נוירונים בתמונות. לכן, יתרון אחד של ה- FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים היא למדוד במדויק הכדאיות בתרביות עצביים ראשוניים בהם צמיחת תאים לא עצביים לא מונע על ידי טכניקות התרבות.

אפופטוזיס נמוך אשלגן המושרה בתרבויות CGN, עם תאים 25K בינוני מטופלים כביקורת, מייצג מודל מצוין ללמוד אפופטוזיס העצבית. קבוצות רבות, כולל המעבדה שלנו, יש להשתמש במחקר זה המודל הקלאסי מנגנוני אפופטוטיים הבסיסית של נוירונים 2 , 11 . לכן, מודל זה שימש כדי לגרום למוות העצבית. ריכוז של צבעים ומשך מכתים בשימוש בפרוטוקול זה כבר אופטימיזציה. ריכוזים נמוכים של צבעים ומשכים קצרים של מכתים יכול לגרום מכתים לא מספיק, מה שמוביל לכניסה מדויקנוירונים מתים. עם זאת, ריכוזים גבוהים של צבעים ומשכים ממושכים של מכתים יכול עוד לגרום למוות העצבית ולגרום הטיה בהערכת הכדאיות התא. לכן, את התמונות יש לקחת בהקדם האפשרי לאחר צבעים מתווספים. ב FDA-PI תמונות מכתים כפול, תאים קטנים FDA חיובי מסומנים נוירונים קיימא. עם זאת, גופים התא נוטים לקבץ בתרבות CGN. לכן, זה יכול להיות קשה להפריד תאים קיימא על ידי מכתים ה- FDA. במחקר זה, Hoechst, כתם גרעיני, שימש כדי לשפר את הדיוק. תאים קטנים עם גופים תא חיובי FDA ו גרעיני חיובי Hoechst ניתן לראות נוירונים קיימא ב- FDA-PI-Hoechst תמונות מכתים משולשת.

בהשוואה מבחני ציטוטוקסיטי colorimetric, FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים דורשים יותר זמן להערכת הכדאיות העצבית בתרבות CGN. לכן, הפרוטוקול הנוכחי עשוי שלא להיות מתאים לסיקור תרופות נוירו-יעילות. עם זאת, הגבלה זוניתן לפתור באמצעות מערכת הדמיה תוכן גבוהה. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא כי CGNs ו Glial לא יכול להיות מופלים על ידי PI. עם זאת, בגלל נוירונים רגישים יותר נוירוטוקסינים מאשר תאים גליה, תאים מתים חיובי PI הם בעיקר נוירונים 12 .

חוץ מזה FDA, PI, ו Hoechst, צבעים אחרים, כגון MTT, SYTO13, ו SYBR14, משמשים גם למדוד כדאיות התא 13 , 14 . עבור assay MTT, תאים גליה שאינם רגישים neurotoxins יכול להמיר MTT כדי formazan, המוביל להערכת יתר של הכדאיות העצבית. SYTO13 הוא חדיר תאים ויש לו תשואה גבוהה פלואורסצנטי ירוק כאשר מחויב ל- DNA או RNA. מחקר קודם הציע כי הכתם SYTO13 בעיקר מציין תאים אפופטוטיים בתרבות CGN אבל לא מבחין תאים גליה מ נוירונים 13 . SYBR14 הוא צבע קרום קבע חומצה גרעין. SYBR14-PI מכתים כפול הוא אותנוכדי למדוד את הכדאיות התא כי הן צבע התווית DNA, ובכך לעקוף את העמימות 14 . עם זאת, SYBR14-PI מכתים כפול לא יכול להבחין ביעילות תאים גליה מ נוירונים בתרבות CGN. לכן, ה- FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים, אשר יכול להבחין בין תאים גליה נוירונים, הם יתרון להערכה מדויקת של הכדאיות העצבית בתרבות CGN.

לבסוף, ה- FDA-PI ו- FDA-PI-Hoechst מכתים אינם מוגבלים לניתוח הכדאיות העצבית בתרבית CGN. תרבויות תאים מעורבים רבים ( למשל, תרבויות קליפת המוח הראשיות ותרבויות בהיפוקמפוס) מכילים נוירונים ותאי גלייה. לכן, אסטרטגיה דומה ניתן ליישם אלה תרבויות תאים מעורבים כדי לנתח במדויק הכדאיות העצבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'ה-ג'יאנג (LY15H310007), פרויקט המחקר היישומי על טכנולוגיה ללא מטרות רווח של פרובינציית ג'ה-ג'יאנג (2016C37110), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U1503223, 81673407) טכנולוגיה שיתוף פעולה פרויקט (2014D10019), Ningbo החדשנות המקומית של מדעי החיים ובריאות (2015C110026), בפרובינצית גואנגדונג שיתוף פעולה בינלאומי פרויקט המדע והטכנולוגיה (מס '2013B051000038), שנזן יסוד מחקר התוכנית (JCYJ20160331141459373), גואנגדונג הונג הונג קונג (15101014), הונג קונג פוליטכני אוניברסיטת (G-YBGQ), ואת KC וונג Magna קרן באוניברסיטת Ningbo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

Neuroscience גיליון 123 נוירונים גרגר Cerebellar diacetate פלואורסצין יודיד propidium כדאיות התא תאים גליה מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter