Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

संतृप्त ग्रेन्युल न्यूरॉन संस्कृति में फ्लोरोससेन डिसासेट-प्रोविडियम आइडॉड डबल स्टीनिंग का प्रयोग न्यूरॉनल व्हबिलिटी का आकलन

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि न्यूरोनलिक व्यवहार्यता को फ्लोरोससेन डिसासेट (एफडीए) और प्रेजिडियम इओडाइड (पीआई) सुसंस्कृत मस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स में डबल धुंधला करते हुए, एक न्यूरोसाइंस में इन विट्रो मॉडल और न्यूरोफार्माकोलॉजी अनुसंधान के रूप में इस्तेमाल की जाने वाली एक प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति का उपयोग करने के तरीके को मापने का तरीका है।

Abstract

प्राथमिक संवर्धित क्रमशः ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (सीजीएन) का प्रयोग व्यापक रूप से न्यूरोसाइंस और न्यूरॉफमैकोलॉजी अनुसंधान में इन विट्रो मॉडल के रूप में किया गया है। हालांकि, सीजीएन संस्कृति में ग्लील कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के सह-अस्तित्व में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के सटीक आकलन में पूर्वाग्रह पैदा हो सकता है। फ्लोरेससेन डायसिसेटेट (एफडीए) और प्रेजिडियम आइडॉड (पीआई) डबल स्टीनिंग का इस्तेमाल व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं के एक साथ मूल्यांकन के द्वारा सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए किया गया है। हम रंगमेट्रिक assays की संवेदनशीलता में सुधार और CGNs में neuronal व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एफडीए-पीआई डबल धुंधला इस्तेमाल किया। इसके अलावा, हमने सटीकता को सुधारने के लिए ब्लू फ्लोरोसेंट डीएनए स्टेंस ( जैसे, होकस्ट) जोड़ा। यह प्रोटोकॉल सीजीएन संस्कृति में इन विधियों का उपयोग करके न्यूरॉनल व्यवहार्यता के मूल्यांकन की सटीकता को सुधारने का तरीका बताता है। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग करते हुए, फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्लिलियल कोशिकाओं की संख्या को बाहर रखा जा सकता है। अवांछित ग्लि को अलग करने के लिए इसी तरह की रणनीति लागू की जा सकती हैविभिन्न मिश्रित सेल संस्कृतियों में न्यूरॉन्स से अल कोशिकाएं, जैसे प्राथमिक cortical संस्कृति और हिप्पोकैम्पल संस्कृति

Introduction

3 - (4, 5-डाइमिथाइल-2-थियाज़ोलिल) -2, 5-डीफिनील-2-एच-टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख के रूप में रंगीनमेट्रिक साइटोटॉक्सिसीटी एसेल्स, सामान्यतः इन विट्रो में सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। चूहों से प्राथमिक सुशोभित क्रमशः ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (सीजीएन) 1-मिथाइल -4-फेनिलपीरीडिनियम आयन, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और ग्लूटामेट 1 , 2 सहित विभिन्न न्यूरोटॉक्सिन के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में सीएजीएन संस्कृतियों का इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सीजीएन संस्कृतियों में न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं सहित कई कोशिकाएं हो सकती हैं, जो सीजीएन संस्कृति में कुल कोशिकाओं में लगभग 1% का योगदान कर सकती हैं। हालांकि, ग्लिएल कोशिकाएं न्यूरॉन्स की तुलना में न्यूरोटॉक्सिन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करती हैं, जो कि रंगीन एसिड 3 द्वारा मापा न्यूरॉनल व्यवहार्यता में एक पूर्वाग्रह की ओर अग्रसर है।

व्यवहार्य कोशिकाओं में, फ्लोरोससेन डिसासेट (एफडीए) को एस्ट्रस द्वारा फ्लोरोसिसिन में परिवर्तित किया जा सकता है।Propidium Iodide (पीआई) मृत कोशिकाओं को मर्मज्ञ करने के बाद डीएनए के साथ बातचीत कर सकते हैं और संस्कृति के भीतर एपोपोसिस का संकेत देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, एफडीए-पीआई डबल धुंधला एक साथ, व्यवहार्य कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकता है, यह सुझाव दे रहा है कि सेल व्यवहार्यता को दोनों रंगीनमितीय विधियों के संयोजन से अधिक सटीक मापा जा सकता है। इसके अलावा, होक्स्ट को जोड़कर, नाभिक के लिए एक नीला फ्लोरोसेंट दाग, सेल व्यवहार्यता की सटीकता को और सुधार किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एफडीए-पीआई डबल धुंधला और एफडीए-पीआई-होकस्ट ट्रिपल स्नेगिंग का वर्णन करता है, जो कि प्राथमिक सभ्य CGN में न्यूरॉनल व्यवहार्यता का सटीक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को उनके अलग-अलग आकारों और आकृतियों के जरिए सीजीएन और ग्लिलियल कोशिकाओं को देखने और उनका विश्लेषण करने का लाभ मिलता है। धुंधला होने के बाद, व्यवहार्य न्यूरॉन्स और मृत न्यूरॉन्स की संख्या को प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ली गई छवियों से गिना जाता है। बड़े आकार की कोशिका कोशिकाओं को ठेठ सीजीएनएस टी की तुलना करके बाहर रखा गया हैचरण कंट्रास्ट मोड के तहत लिया उन लोगों के साथ फ्लोरोसेंट मोड के तहत एक चिह्न न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं, जैसे कि प्राथमिक cortical संस्कृतियों और हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों युक्त मिश्रित सेल संस्कृतियों में न्यूरॉनल व्यवहार्यता को मापने के लिए एक समान रणनीति की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रक्रियाओं ने नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) गाइड और लेबोरेटरी एनिमल (नेशनल पब्लिकेशंस नं। 80-23, संशोधित 1996) के लिए मार्गदर्शिका और निंगबो विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया SYXK-2008-0110)।

1. समाधान और संस्कृति मीडिया की तैयारी

नोट: बाँझ शर्तों के तहत अभिकर्मकों और स्टॉक को तैयार करने की आवश्यकता है। 0.22 सुक्ष्ममापी आकार के एक छिद्र के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणु।

  1. डबल-डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच 2 ओ) के 10 एमएल के 5 मिलीग्राम पीएलएल को जोड़कर पॉली एल एलिसिन (पीएलएल) स्टॉक समाधान तैयार करें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पीएलएल स्टॉक समाधान की व्याख्या करना और स्टोर करना।
  2. 7.45 ग्राम NaCl, 0.4 ग्राम केएलएल, 0.14 ग्राम NaH 2 पीओ 4 , 2.6 ग्राम डी-ग्लूकोस और 5.94 ग्राम 4- (2-हाइड्रॉक्सीथाइल) -1-पिपरीज़ेथेनसल्फोनिक एसिड को 100 एमएल तक जोड़कर क्रैब्स बफर तैयार करें। डीडीएच 2 </ Sub> हे। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित क्रेब्स बफर समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस तक एक महीने तक स्टोर करें।
  3. 3.82% एमजी 2 एसओ 4 समाधान तैयार करें 3.82 ग्राम एमजी 2 SO 4 से 100 एमएल डीडीएच 2 ओ। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणु। कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एमजी 2 एसओ 4 समाधान स्टोर करें।
  4. 1.2 ग्राम CaCl 2 समाधान को 1.2 ग्राम CaCl 2 से 100 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर तैयार करें फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणु। कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर CaCl 2 समाधान को स्टोर करें।
  5. 2 ग्राम किलोवाट का समाधान तैयार करें जो कि 15 ग्राम केएलएल को 100 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर फ़िल्टरिंग के द्वारा जीवाणु। कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केएलसी समाधान को स्टोर करें।
  6. डी-ग्लूकोस के 1.8 ग्राम को डीएमएचएच 2 ओ के 100 एमएल तक जोड़कर डी-ग्लूकोज स्टॉक समाधान तैयार करें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणु। विभेदक और डी-ग्लूकोस समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस तक एक महीने तक स्टोर कर सकते हैं।
  7. Cytosine β-D-Arabinofuranoside (आरा-सी) स्टॉक solut तैयार करेंआयन को 0.24 ग्राम अरा-सी से 10 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर फ़िल्टरिंग के द्वारा जीवाणु। कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अरा-सी शेयर समाधान को विभाजित करने और स्टोर करना।
  8. 25 मिलीलीटर भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस), 2.5 एमएल ऑफ़ 100x ग्लूटामाइन, 2.78 एमएल ऑफ 2 एम केएल समाधान, और बेसल मध्यम ईगल (बीएमई) में 100 एमएएल एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके 250 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम (25-30 पिल्ले के लिए) तैयार करें। । मात्रा को 250 एमएल तक समायोजित करें और फ़िल्टरिंग द्वारा बाँझें।
  9. 2.5 एमएल का 100x ग्लूटामाइन, 2.78 एमएल 2 एम केएल समाधान, और बीएमई में 2.5 एमएल 100x एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके 25 किलो मध्यम तैयार करें। मात्रा को 250 एमएल तक समायोजित करें और फ़िल्टरिंग द्वारा बाँझें।
  10. बीएमई में 2.5 एमएल 100x ग्लूटामाइन और 2.5 एमएल का 100 एक्स एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके 5 के माध्यम तैयार करें। मात्रा को 250 एमएल तक समायोजित करें और फ़िल्टरिंग द्वारा बाँझें।
    नोट: संस्कृति माध्यम, 25 मी माध्यम, और 5 के माध्यम से ताजा तैयार होने की आवश्यकता है
  11. एडीटोन के 5 मिलीग्राम एफडीए को 1 एमएल एसीटोन जोड़कर एफडीए स्टॉक समाधान तैयार करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए एफडीए स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें/ Li>
  12. पीआई स्टॉक समाधान तैयार करें 1 मिलीग्राम पीआई को 1 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर। पीआई शेयर समाधान को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  13. Hoechst स्टॉक समाधान को 5 mg Hoechst 33342 से 1 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर तैयार करें। Hoechst स्टॉक समाधान को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. विच्छेदन समाधान की तैयारी

नोट: विच्छेदन से पहले इस 1 घ करो।

  1. क्रेब्स बफर के 15 एमएल, 3.82% एमजी 2 एसओ 4 समाधान, और 0.45 ग्राम बोवाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) को 150 एमएल डीडीएच 2 ओ के 15 मिलीलीटर जोड़कर विच्छेदन समाधान तैयार करें।
  2. लेबल 5 x 50 एमएल ट्यूब निम्नानुसार हैं: 1, 2, 3, 4, और 5
  3. एक फिल्टर के साथ 50 एमएल सिरिंज में विच्छेदन समाधान के 40 एमएल रखें। ट्यूब 1 में विच्छेदन समाधान के 30 एमएल, और 2 एमएल प्रत्येक को कई 35 मिमी सेल संस्कृति व्यंजनों में फ़िल्टर करें, जो ऊतकों को संसाधित करने के लिए उपयोग किया जाएगा।
  4. टी के लिएUbe 2, 50 मिलीलीटर विच्छेदन समाधान में 12.5 मिलीग्राम ट्रिप्सिन जोड़ने। भंवर से पूरी तरह मिक्स करें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित
  5. ट्यूब 3 के लिए, 1.2 मिलीग्राम डीएनसी I, 7.8 मिलीग्राम सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक, और 150 μL 3.82% एमजी 2 एसओ 4 समाधान में 15 एमएल विच्छेदन समाधान में जोड़ें। भंवर से पूरी तरह मिक्स करें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित
  6. ट्यूब 4 के लिए, ट्यूब से समाधान का 5 एमएल जोड़ें 3. विच्छेदन समाधान के 10.5 एमएल जोड़ें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित
  7. ट्यूब 5 के लिए, विसर्जन समाधान के 12.5 एमएल में 3.82% एमजी 2 एसओ 4 समाधान के 100 μL और 1.2% CaCl 2 समाधान के 15 μL जोड़ें। भंवर से पूरी तरह मिक्स करें। फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित
  8. उपयोग के पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों को स्टोर करें।

3. सेल संस्कृति प्लेट्स कोटिंग

नोट: विच्छेदन से पहले इस 1 घ करो।

  1. 100 एमएल डीडीएच 2 ओ (अंतिम एकाग्रता: 5 माइक्रोग्राम / एमएल) में पीएलएल स्टॉक समाधान के 1 एमएल जोड़ें। कोट प्लास्टिक6-अच्छी तरह से या 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (5 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 2 मिलीलीटर या 12 मिलीग्राम सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से) पाली-एल-लाइसिन समाधान के 5 ग्राम / एमएल जोड़कर
  2. 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर सेते (या 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर) विच्छेदन से 1-2 घंटे पहले, विंदुक का उपयोग करके समाधान को हटा दें। सेल संस्कृति हुड में डीडीएच 2 ओ और सूखे के साथ एक बार धोएं।

4. 8 दिनों के पुराने स्प्रेग-डावली चूहे के लिए प्रसंस्करण के ऊतकों।

  1. बर्फ पर 100 मिमी का डिब्बा रखो। निष्फल कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके चूहे के पिल्ले को डिश में डाल दें।
  2. कैमरन को फॉममेन मैग्नम में डालें और खोपड़ी के दोनों किनारों को कान से कानों तक काटें। संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके खोपड़ी लिफ्ट। यह सुनिश्चित करें कि पूरे मस्तिष्क खोपड़ी में है। सेरेबेलम को अलग करें और संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके उपरोक्त 35 मिमी डिश में डाल दें।
  3. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कार्य करें मेन्निंज और रक्त वाहिकाओं को संदंश के दो जोड़े से निकालें।
  4. एक ब्लेड के साथ ऊतकों को तोड़ो। ऊतकों को ट्यूब में रखें 1. आरटी पर 5 मिनट और 1,500 x ग्राम के लिए अपकेंद्रित्र
  5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate गोली बचाओ
  6. गोली के लिए ट्यूब 2 में समाधान जोड़ें। धीरे से मिलाते हुए Resuspend
  7. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नल में ट्यूब रखें। धीरे से हर 3 मिनट हिला
  8. इस समाधान के लिए ट्यूब 4 में समाधान जोड़ें। आरके पर 5 मिनट और 1500 x ग्राम के लिए शेक और अपकेंद्रित्र
  9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate गोली बचाओ
  10. गोली resuspend करने के लिए ट्यूब 3 में समाधान जोड़ें।
  11. दो 15 एमएल ट्यूबों को तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब में आधे भाग कोशिकाओं में रखें। कोशिकाओं को एकजुट करने के लिए कपास-प्लग किए गए पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 60-70x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  12. प्रत्येक 15-एमएल ट्यूब के लिए ट्यूब 5 में समाधान के 3 एमएल जोड़ें। उन्हें 10 मिनट के लिए आरटी पर बैठते हैं और फिर सतह पर तैरने वाले को कपास से चिपकाने वाले पाश्चर पिपेट के साथ ध्यान से हटा दें। सतह पर तैरनेवाला को 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेंटीफ्यूज को आरटी पर 5 मिनट और 1500 x ग्राम में रखें।
  13. एसतह पर तैरनेवाला उत्साही गोली बचाओ
  14. करीब 1.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल (10 पिल्ले के लिए लगभग 100 एमएल) की एक सेल घनत्व पाने के लिए संस्कृति के माध्यम को गोली में जोड़ें।
  15. कक्षों को संस्कृति प्लेटों में रखो और उन्हें इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रखें।

5. कल्चरिंग के दौरान अरा-सी और डी-ग्लूकोस में वृद्धि

  1. 24 घंटे के बाद, ऐलो-सी स्टॉक समाधान (10 μL / अच्छी तरह से 12-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेटेट्स या 20 μL / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट्स के लिए; अंतिम एकाग्रता: 1 एमएम) ग्लिअल कोशिकाओं के विकास को रोकें।
  2. 7 दिन, 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए प्रति अच्छी तरह प्रति 50 μL डी-ग्लूकोज शेयर समाधान जोड़ें या 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 100 μL प्रति अच्छी तरह से जोड़ें ताकि अंतिम एकाग्रता 1 एमएम हो।

6. सीजीएन संस्कृति में एफडीए-पीआई डबल स्टीनिंग और एफडीए-पीआई-होचस्ट ट्रिपल स्टीनिंग

  1. एफडीए स्टॉक समाधान के 20 μL जोड़कर एफडीए-पीआई कार्यशील समाधान तैयार करें (अंतिम एकाग्रता: 10 माइक्रोग्राम / एमएल) और पीआई स्टॉक समाधान के 10 एमएल में 50 μL पीआई स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता: 50 माइक्रोग्राम / एमएल) भंवर द्वारा मिक्स करें और इसे बर्फ पर रखें
    1. एफडीए-पीआई-होक्स्ट के कामकाजी समाधान के लिए, एफडीए स्टॉक समाधान के 20 μL (अंतिम एकाग्रता: 10 माइक्रोग्राम / एमएल), पीआई स्टॉक समाधान के 50 μL (अंतिम एकाग्रता: 50 माइक्रोग्राम / एमएल), और एचईसीएच स्टॉक समाधान के 10 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता: 5 माइक्रोग्राम / एमएल) पीबीएस के 10 एमएल में। भंवर द्वारा मिक्स करें और इसे बर्फ पर रखें
      नोट: उपयोग करने से पहले एफडीए-पीआई कार्य समाधान और एफडीए-पीआई-होकस्ट काम करने के समाधान के लिए हौसले से तैयार करें।
  2. इनक्यूबेटर से सेल संस्कृति प्लेट ले लो। इसे बर्फ पर रखो
  3. संस्कृति के माध्यम से आकांक्षी और इसे ठंडे पीबीएस के साथ बदलें।
    नोट: समाधान का परिवर्तन धीरे-धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए। विंदुक युक्तियों के साथ कोशिकाओं को छूने से बचें
  4. ठंड पीबीएस की आकांक्षा और इसे ठंडा एफडीए-पीआई या एफडीए-पीआई-होकस्ट काम समाधान (500 μL / हम12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों या 1 एमएल / 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट्स के लिए अच्छी तरह से करेंगे)। 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें
  5. एफडीए-पीआई या एफडीए-पीआई-होकस्ट कामकाजी समाधान को महाप्राणित करते हैं और ठंड पीबीएस (100 μL / 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट्स या 50 μL / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए) के लिए जोड़ते हैं।
    नोट: छवियों को लेते समय कोशिकाओं को सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए
  6. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करके चित्र लें 450 - 4 9 0 एनएम के पास बैंड के साथ उत्तेजना फ़िल्टर का उपयोग करें एफडीए, पीआई और होकस्ट के लिए क्रमशः 520, 620, और 460 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाएं। उसी परिस्थितियों में, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के चरण कंट्रास्ट मोड का उपयोग करके एक सामान्य प्रकाश के तहत एक छवि ले लो।
    नोट: एफडीए-पीआई या एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टैनिंग के 15 मिनट के भीतर चित्र लें। जोखिम समय 100-300 एमएस है और एनालॉग लाभ 2.8x है।

7. न्यूरॉनल व्यवहार्यता का आकलन

  1. एफडीए-पीआई डबल धुंधला हो जाने के लिए फ़िल्टरिंग के बाद की गई कोशिकाओं की छवियों को ओवरले करनाग्राफिक एडिटर सॉफ्टवेयर में पीआई-पॉजिटिव लेयर पर एफडीए-पॉजिटिव लेयर को खींचकर अलग-अलग प्रतिदीप्ति फिल्टर द्वारा
    1. "परतें" पैनल के "अस्पष्टता" फ़ील्ड में "50%" दर्ज करके एफडीए-पॉजिटिव परत की अस्पष्टता को समायोजित करें। "परत" मेनू में "मर्ज विज़िबल" बटन पर क्लिक करके दो परतें मर्ज करें। "छवि" | के अंतर्गत "कंट्रास्ट" फ़ील्ड में "50" दर्ज करके ओवरले छवियों के विपरीत सेट करें "समायोजन" | "दमक भेद।" सुनिश्चित करें कि उपरिशायी छवियों में कोई एफडीए और पीआई डबल-पॉजिटिव सेल नहीं है।
  2. एफडीए-पीआई-होकस्ट ट्रिपल स्टैनिंग के लिए, ग्राफिक्स एडिटर सॉफ्टवेयर में पीआई-पॉजिटिव लेयर पर एफडीए-पॉजिटिव लेयर को खींचकर विभिन्न प्रतिदीप्ति फिल्टर को छानने के बाद कोशिकाओं की छवियों को ओवरले लगाया गया है। "परतों और # के" अस्पष्टता क्षेत्र में "50%" दर्ज करके एफडीए-पॉजिटिव परत की अस्पष्टता को समायोजित करें34; पैनल।
    1. "परत" मेनू में "मर्ज विज़िबल" बटन पर क्लिक करके दो परतें मर्ज करें। मर्ज किए गए परत पर Hoechst-positive परत खींचें। "परतें" पैनल के "अस्पष्टता" क्षेत्र में "50%" दर्ज करके Hoechst-positive परत की अस्पष्टता को समायोजित करें। "परत" मेनू में "मर्ज विज़िबल" बटन पर क्लिक करके दो परतों को मिलाएं।
  3. सीजीएन के फ्लोरोसेंट मोड में ली गई छवियों की तुलना करके सीजीएन के बड़े, अनियमित ग्लियाल कोशिकाओं को अलग-अलग रूप से अलग करना - सीजीएन से तीन गुना बड़ा व्यास वाले कोशिकाओं को ग्लियाल कोशिका माना जाता है और इसे बाहर रखा जाना चाहिए।
  4. इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम ( जैसे, इमेजजे) में एक सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग करके क्रमशः व्यवहार्य न्यूरॉन्स और मृत न्यूरॉन्स की संख्या की गणना करें।
    1. एफडीए-पीआई डबल धुंधला के लिए, मैन्युअल रूप से छोटी एफडीए-पॉजिटिव कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से चिह्नित करेंव्यवहार्य न्यूरॉन्स मृतक न्यूरॉन्स के रूप में पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से चिह्नित करें एफडीए-पीआई-होकेस्ट ट्रिपल स्नेगिंग के लिए, मैन्युअल रूप से छोटी एफडीए-और होइचस्ट-डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को व्यवहार्य न्यूरॉन्स के रूप में चिह्नित करते हैं। मैन्युअल रूप से पीआई- और होचस्ट-डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को मृत न्यूरॉन्स के रूप में चिह्नित करें।
  5. निम्न समीकरण का उपयोग करके न्यूरॉनल व्यवहार्यता के प्रतिशत की गणना करें: न्यूरॉनल व्यवहार्यता का% [व्यवहार्य न्यूरॉन्स की संख्या (/ मृत न्यूरॉन्स की संख्या + व्यवहार्य न्यूरॉन्स की संख्या)] x 100%। हर अच्छी तरह से, पांच यादृच्छिक क्षेत्रों का चयन करें और न्यूरॉनल व्यवहार्यता का प्रतिशत औसत।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जीएपी 43 (लाल) और जीएफएपी (हरा) का दोहरी इम्यूनोस्टाईन का प्रयोग क्रमशः न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के आकार का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, क्रमशः 2 , 5 । सीजीएन संस्कृति दोनों में न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिका मौजूद हैं। GFAP- सकारात्मक glial कोशिकाओं आकार में बड़े और अनियमित हैं, जैसा कि छवियों ( चित्रा 1 ) में तीर द्वारा दर्शाया गया है। सेल जीवन शक्ति के लिए पारंपरिक assays न्यूरॉन्स से glial कोशिकाओं भेद जब न्यूरॉनल व्यवहार्यता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टैनिंग, जो न्यूरॉन्स से ग्लियाल कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं, सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के सटीक मूल्यांकन के लिए लाभप्रद हैं।

कम-पोटैशियम चुनौती का उपयोग सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल मौत को प्रेरित करने के लिए किया गया था। प्रतिनिधि छवियां कम-पोटेशियम माध्यम (5 के), सामान्य माध्यम (25 के) या उत्पत्ति के साथ चुनौती देने वाली सीजीएन संस्कृति को दर्शाती हैंएफएडीए-पीआई डबल धुंधलापन ( चित्रा 2 ए ) या एफडीए-पीआई-होइचस्ट ट्रिपल स्नेनिंग ( चित्रा 2 बी ) द्वारा विश्लेषण के रूप में नल माध्यम। विभिन्न तरीकों से मापा न्यूरॉनल व्यवहार्यता 3 चित्रा (मतलब ± एसईएम) में प्रस्तुत की गई है। नियंत्रण में एफडीए-पीआई डबल धुंधला द्वारा मापा सेल viabilities, क्रमशः 25, और 5 के समूह 99.8 ± 4.2%, 98.2 ± 2.9%, और 43.9 ± 8.6%, क्रमशः ( चित्रा 3 ए ) थे। नियंत्रण में एफडीए-पीआई-होकस्ट ट्रिपल स्नेनिंग द्वारा मापा गया सेल viabilities, क्रमशः 25, और 5 के समूह 99.8 ± 1.6%, 96.7 ± 4.4%, और 48.3 ± 4.4%, क्रमशः ( चित्रा 3 बी )। नियंत्रण में एमटीटी परख द्वारा मापा गया सेल viabilities, 25K, और 5 के समूह क्रमशः 102.1 ± 3.9%, 96.5 ± 1.7%, और 57.5 ± 5.7%, क्रमशः ( चित्रा -3 सी ) थे। नियंत्रण, 25 के, और 5 के समूहों में लैक्टिक डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज की प्रतिशतियां क्रमशः 100.0 ± 5.5%, 94.5 ± 11.2% और 202.1 ± 15.3% थीं ( 2 द्वारा सीधा गणना नहीं की जा सकती। एमटीटी परख एनएडीएफ़एच-आश्रित सेलुलर ऑक्सीड्रोडक्टेस की गतिविधि का मूल्यांकन करता है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को दर्शाता है 2 । हालांकि, सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, जब यह तंत्र न्यूरॉन्स से ग्लोरी कोशिकाओं को अलग नहीं कर सकता। एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होकस्ट स्टेंसिंग का उपयोग करके, ग्लियाल कोशिकाओं की संख्या को बाहर रखा जा सकता है, और न्यूरॉनल व्यवहार्यता को सही तरीके से मापा जा सकता है। इसके अलावा, एफडीए-पीआई या एफडीए-पीआई-होकस्ट स्केनिंग द्वारा मापा गया 5 के मध्यम-इलाज वाले सीजीएन में न्यूरॉनल व्यवहार्यता एमटीटी परख द्वारा मापा गया था। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि अधिकांश ग्लैबल कोशिकाएं जो 5-के माध्यम से प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी के प्रति संवेदनशील नहीं थीं, उन्हें एफडीए-पीआई या एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टेंसिंग द्वारा बाहर रखा गया था, लेकिन एमटीटी परख द्वारा नहीं।

आकृति 1
चित्रा 1: दोनों छोटे न्यूरॉन्स और बड़े, अनियमित ग्लियाल सेल CGN संस्कृति में मौजूद हैं। दिन में 8 में , सीजीएन के क्रमशः दोहरे जीओपी 43 (लाल) और जीएफएपी (हरा) के साथ न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के लिए क्रमशः दोहरे थे। चरण के विपरीत छवियों कोशिकाओं के आकारिकी दिखाते हैं। सेल जीवन शक्ति के लिए पारंपरिक assays न्यूरॉन्स से glial कोशिकाओं भेद जब न्यूरॉनल व्यवहार्यता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टैनिंग, जो न्यूरॉन्स से ग्लियाल कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं, सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के सटीक मूल्यांकन के लिए लाभप्रद हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन नीला तीर: ठेठ न्यूरॉन्स; सफेद तीर: ठेठ glial कोशिकाओं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
एफडीए-पीआई डबल स्टीनिंग और एफडीए-पीआई-होचस्ट ट्रिपल स्टैनिंग सीजीएन संस्कृति में कम पोटेशियम से प्रेरित न्यूरॉनल मौत का प्रदर्शन। दिन में 8 दिन में, सीजीएन संस्कृतियों को 5 के या 25 के माध्यम से स्विच किया गया था। नियंत्रण संस्कृतियों में मध्यम नहीं बदला गया था। चुनौती के 24 घंटे के बाद, सीएजीएन संस्कृतियों ( ए ) एफडीए-पीआई डबल धुंधला हो जाना या ( बी ) एफडीए-पीआई-होकेस्ट ट्रिपल स्टेंसिंग द्वारा परख दिया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन तीर: ठेठ glial कोशिकाओं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: CGN संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता का मात्रा। दिन में 8 दिन में, सीजीएन संस्कृतियों को 5 के या 25 के माध्यम से स्विच किया गया था। नियंत्रण संस्कृति में माध्यमएस नहीं बदला था। चुनौती के 24 घंटे के बाद, सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण ( ए ) एफडीए- पीआई डबल धुंधला हो गया, ( बी ) एफडीए-पीआई-होइ्चस्ट ट्रिपल स्टेनाइजिंग, और ( सी ) एमटीटी परख। ( डी ) एलडीएच रिसाव एलडीएच परख द्वारा विश्लेषण किया गया था। आंकड़े ± एसईएम के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। ** p <0.01 बनाम नियंत्रण (एनोवा, ट्यूकी का परीक्षण) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल को प्रक्रियाओं से संशोधित किया गया था जिन्हें पहले 6 , 7 में वर्णित किया गया है। इन विट्रो 8 में प्राथमिक न्यूरॉन्स को संवर्धन करते समय शोधकर्ताओं ने नॉन-न्यूरोनल सेल विकास को कम करने की कोशिश की है। हालांकि, यहां तक ​​कि बेहतर संस्कृति की स्थिति के साथ, कुछ ग्लिअल कोशिकाएं अभी भी रहती हैं। इसके अलावा, न्यूरोनल कोशिकाओं को प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में आवश्यक है क्योंकि वे न्यूरोनल विकास और परिपक्वता 9 में सहायता करते हैं । इस अध्ययन में, आरा-सी का उपयोग ग्लियाल कोशिकाओं के विकास को कम करने के लिए किया गया था, हालांकि अभी भी सीजीएन संस्कृति में 1-5% ग्लिलियल कोशिकाओं की उपस्थिति थी। यह समस्या अन्य समूहों के अध्ययन 10 में भी प्रस्तुत की गई है। सीजीएन संस्कृति में, ग्लायल कोशिकाओं के आकार और आकार बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स से भिन्न होते हैं। सीजीएन के व्यास लगभग 10 माइक्रोन हैं, और परिपक्व सीजीएन के पास समृद्ध प्रक्रियाएं हैं जो न्यूरॉन्स से जुड़ती हैं। होवेदेखें, संस्कृति में ग्लील कोशिकाओं का व्यास रिश्तेदार बड़ा है, लगभग 30-100 सुक्ष्ममापी, इसलिए छवियों में न्यूरॉन्स से ग्लिल कोशिकाओं को अलग करना आसान है। इसलिए, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होकस्ट स्टेंसिंग का एक फायदा प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में न्यूरॉनल व्यवहार्यता को सही तरीके से मापना है, जिसमें गैर-न्यूरॉनल सेल ग्रोथ संस्कृति की तकनीक से नहीं रोकती है।

सीजीएन संस्कृतियों में कम-पोटेशियम-प्रेरित एपप्टोसिस, नियंत्रण के रूप में 25 के माध्यम से इलाज वाली कोशिकाओं के साथ, न्यूरोनल एपोपोसिस का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। हमारे प्रयोगशाला समेत कई समूहों ने इस क्लासिक मॉडल का इस्तेमाल न्यूरॉन्स 2 , 11 के अंतर्निहित अपोपकारी तंत्र का अध्ययन किया है। इसलिए, इस मॉडल का प्रयोग न्यूरॉनल मौत को प्रेरित करने के लिए किया गया था। रंजक की एकाग्रता और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाली धुंधली की अवधि को अनुकूलित किया गया है। रंगों की कम सांद्रता और धुंधला हो जाने के कम समय में अपर्याप्त धुंधला हो सकता है जिससे गलत युग्म हो सकती हैमृत न्यूरॉन्स की नटिंग हालांकि, रंजक और लंबे समय तक धुंधला होने के लंबे समय तक होने के कारण, न्यूरॉनल मौत पैदा हो सकती है और सेल व्यवहार्यता के अनुमान में पूर्वाग्रह का कारण बन सकता है। इसलिए, रंजक जोड़े जाने के बाद जितनी जल्दी हो सके चित्रों को ले जाना चाहिए। एफडीए-पीआई डबल धुंधला छवियों में, छोटे एफडीए पॉजिटिव कोशिकाओं को व्यवहार्य न्यूरॉन्स के रूप में चिह्नित किया जाता है। हालांकि, सेल निकाय सीजीएन संस्कृति में समूह बनाते हैं। इसलिए, एफडीए धुंधला होकर व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल हो सकता है। इस अध्ययन में, होक्स्ट, एक परमाणु दाग ​​का उपयोग सटीकता को सुधारने के लिए किया गया था। एफडीए-पॉजिटिव सेल बॉडीज़ और हॉचस्ट पॉजिटिव नाभिक वाले लघु कोशिकाओं को एफडीए-पीआई-होकस्ट ट्रिपल स्टेंसिंग इमेज में व्यवहार्य न्यूरॉन्स माना जा सकता है।

रंगमेट्रिक साइटोटॉक्सिसिटी एसेज की तुलना में, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टेंसिंग को सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं को स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। हालांकि, यह सीमाएक उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके हल किया जा सकता है इस तकनीक का एक और सीमा यह है कि सीजीएन और ग्लील को पीआई द्वारा भेदभाव नहीं किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि न्यूरॉन्स ग्लियाय कोशिकाओं की तुलना में न्यूरोटॉक्सिन्स के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, पीआई पॉजिटिव मृत कोशिकाएं मुख्यतः न्यूरॉन्स 12 हैं ।

एफडीए, पीआई और हईचस्ट के अलावा, एमटीटी, SYTO13 और SYBR14 जैसी अन्य रंजक, सेल व्यवहार्यता 13 , 14 को मापने के लिए भी उपयोग किया जाता है। एमटीटी परख के लिए, ग्लोरी कोशिकाएं जो न्यूरोटॉक्सिन के प्रति संवेदनशील नहीं हैं, एमटीटी से फ़ैशनजन परिवर्तित कर सकती हैं, जिससे न्यूरॉनल व्यवहार्यता के अधिक अनुमान लगते हैं। SYTO13 सेल पारगम्य है और डीएनए या आरएनए के लिए बाध्य जब एक उच्च हरी फ्लोरोसेंट उपज है पिछले अध्ययन में यह सुझाव दिया गया कि SYTO13 धुंधला मुख्य रूप से सीपीएन संस्कृति में एपोपोटिक कोशिकाओं को इंगित करता है लेकिन न्यूरॉन्स 13 से ग्लोरी कोशिकाओं को अलग नहीं करता। SYBR14 झिल्ली-स्थायी न्यूक्लिक एसिड डाई है SYBR14-PI डबल धुंधला हो हमेंएडी सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए क्योंकि दोनों रंगों में डीएनए का लेबल होता है, जिससे अस्पष्टता 14 को बाधित किया जा सकता है। हालांकि, SYBR14-PI डबल धुंधला सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉन्स से ग्लोरी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से अलग नहीं कर सकता है। इसलिए, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टैनिंग, जो न्यूरॉन्स से ग्लियाल कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं, सीजीएन संस्कृति में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के सटीक मूल्यांकन के लिए लाभप्रद हैं।

अंत में, एफडीए-पीआई और एफडीए-पीआई-होक्स्ट स्टैनिंग सीजीएन संस्कृतियों में न्यूरॉनल व्यवहार्यता के विश्लेषण तक सीमित नहीं हैं। कई मिश्रित सेल संस्कृतियों ( जैसे, प्राथमिक cortical संस्कृतियों और प्राथमिक हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों) में न्यूरॉन्स और ग्लिअल कोशिकाएं भी शामिल हैं इसलिए, न्यूरॉनल व्यवहार्यता का सही विश्लेषण करने के लिए उन मिश्रित सेल संस्कृतियों के लिए इसी तरह की रणनीति लागू की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम Zhejiang प्रांत (LY15H310007) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, Zhejiang प्रांत (2016 सी 37110) के गैर-लाभकारी प्रौद्योगिकी पर एप्लाइड रिसर्च प्रोजेक्ट, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (यू 1 503223, 81673407), निंगबो अंतर्राष्ट्रीय विज्ञान और अनुदान द्वारा समर्थित था। प्रौद्योगिकी सहयोग परियोजना (2014 डी 10019), लाइफ साइंस एंड हेल्थ (2015 सी 110026), गुआंग्डोंग प्रांतीय अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना विज्ञान और प्रौद्योगिकी (नं। 2013 बी 0551000038), शेन्ज़ेन बेसिक रिसर्च प्रोग्राम (जेसीवायजे 036033114145 9 373), गुआंग्डोंग-हांग हांगकांग पॉलिटेक्निक यूनिवर्सिटी (जी-वाईबीजीक्यू), और केंसी वोंग मैग्ना फंड नेंगबो विश्वविद्यालय में कोंग टेक्नोलॉजी कोऑपरेशन फ़ंडिंग स्कीम (जीएचपी / 012/16 जीडी), रिसर्च ग्रांट्स कौंसिल ऑफ़ हांगकांग (15101014),

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 123 सेरेबेलर ग्रेन्युल न्यूरॉन्स फ्लोरोसिसिन डिसासेट प्रोपीडियम आयोडाइड सेल व्यवहार्यता ग्लियाल कोशिकाएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
संतृप्त ग्रेन्युल न्यूरॉन संस्कृति में फ्लोरोससेन डिसासेट-प्रोविडियम आइडॉड डबल स्टीनिंग का प्रयोग न्यूरॉनल व्हबिलिटी का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter