وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em> المتفطرة السلية</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
السل (TB) لا يزال يشكل تهديدا الصحة العالمية خطيرا على الرغم من توفر نظم العلاج الكيميائي لمكافحة السل لأكثر من 40 سنوات 1. وهذا يرجع جزئيا إلى شرط لفترات علاج طويلة لأكثر من 6 أشهر باستخدام مزيج من الادوية متعددة، الأمر الذي يؤدي إلى المريض عدم الامتثال 2 هذا. وظهور السل المقاوم للأدوية في السنوات الأخيرة من تعقيد المشاكل في الميدان حيث التنمية الناجحة من الأدوية المعتمدة سريريا هي شبه معدومة 3. في الواقع، على الرغم من تطوير الأدوية المضادة للسل شاملة، كان فقط دواء واحد وافقت ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام السريري في السنوات ال 40 الماضية (4). وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى الأجيال الجديدة من الأدوية المضادة للسل لمعالجة هذه المشكلة.
المشكلة الرئيسية في اكتشاف السل المخدرات هي عدم وجود النقل الناجح من مركبات مع في المختبر النشاط إلى فعالية في الإعداد السريرية= "XREF"> 5، 6، 7. في البداية، تم استخدام النهج الهدف استنادا للكشف عن مكافحة المخدرات المتفطرات السلية 5، الذي فشل في ترجمتها إلى الخلايا البكتيرية بأكملها. حتى عندما يتم استخدام خلايا المتفطرة السلية، وغالبا ما يتم تنفيذ ذلك باستخدام مرق نمت الثقافات، التي لا التنبؤ بدقة فعالية الدواء في الجسم الحي 8 و 9. وقد تم التعرف على هذه المشاكل وتم المقايسات فحص المخدرات ضد الضامة التي تحتوي على المتفطرات السلية أو الكامنة المتفطرات السلية أنشأت بنجاح 8، 10، 11، 12. ولكن، حتى هذه المقايسات أكثر تقدما لا تعطي الاعتبار الكافي للحواجز الاختراق التي تواجهها المخدرات في الآفات الرئوية غير أوعية دموية، وفي بؤر نخرية في موقع الإصابة. في الواقع، حتى للخط الأول السل ريفامبيسين المخدرات، وقد تم استجواب الجرعات دون المستوى الأمثل نظرا لعدم كفاية في أنسجة الجسم الحي والدماغية السائل الشوكي (CSF) اختراق 13، 14، 15 وكذلك انخفاض كفاءة الخلايا ضد المتفطرة السلية 8 و 9. على هذا النحو، ونماذج وفحوصات جديدة من شأنها أن تأخذ بعين الاعتبار هذه المعلمات أثناء عملية التنمية الرصاص في وقت مبكر من شأنه أن يحسن بلا شك السل جهود اكتشاف المخدرات.
لتلبية هذه الحاجة، أنشأنا مؤخرا-2 BSL متوافق نموذج العدوى بديل غير مكلف وسريع، والمتفطرات السلية المخدرات فعالية الاختبار 16. هذا النموذج عدوى تنتج المكتظة معبأة المتفطرات السلية داخل هياكل الإجمالية البلاعم الكبيرة، والتي لخص الحواجز معدل انتشار الهواتف النقالة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ولدت بلعم-passaged <eم> المتفطرات السلية مع الحالة الفيزيولوجية تغير تشبه الكامنة المتفطرات السلية. المواضيع المتميزة المستمدة من هذا النموذج العدوى ودمجها مع فحص ريسازورين عيار مكروي (REMA) لتقييم نجاعة الأدوية، والتي تنتج نتائج متسقة مع نماذج إصابة الخلايا الأخرى وربطها بشكل جيد مع القدرة ذكرت من أدوية السل المشتركة لتحقيق تركيزات عالية CSF النسبية لتركيزات مصل 16.
نحن هنا تصف بالتفصيل جيل من المتفطرات السلية / الهياكل الكلية بلعم لإنتاج بلعم passaged المتفطرات السلية مناسبة لاختبار الحساسية المخدرات باستخدام REMA. على وجه الخصوص، وتبين لنا كيف يمكن تكييف هذا النظام العدوى إلى تنسيق 96-جيدا من أجل التوافق مع الفحص الإنتاجية مرشح الأدوية المضادة للسل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، التي وصفناها في التفاصيل بديلا المتفطرات السلية نموذج العدوى مناسبة لاختبار فعالية الدواء. يأخذ هذا النموذج في الاعتبار اثنين من العوامل الرئيسية التي ينبغي إيلاء المزيد من الاهتمام خلال عملية التنمية السل المخدرات في وقت مبكر: وجود الحواجز ذات الصلة من ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
