Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em> Микобактерии туберкулеза</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
Туберкулез (ТБ) остается серьезной угрозой глобального здравоохранения , несмотря на наличие противотуберкулезных режимов химиотерапии в течение более 40 лет 1. Это связано отчасти с требованием в течение длительного периода лечения в течение 6 месяцев с использованием нескольких комбинаций лекарственных препаратов, что приводит к пациенту несоблюдения 2. Возникновение лекарственно-устойчивого туберкулеза в последние годы еще более усугубляются проблемы в области , где успешное развитие клинически одобренных препаратов практически не существует 3. Действительно, несмотря на исчерпывающий разработки лекарственных средств против туберкулеза, только один препарат был одобрен FDA для клинического использования в течение последних 40 лет 4. Таким образом, крайне необходимы новые поколения противотуберкулезных препаратов для решения этой проблемы.
Ключевой проблемой в обнаружении наркотиков ТБ является отсутствие успешной передачи из соединений с активностью в пробирке эффективности в клинических условиях= "Xref"> 5, 6, 7. Первоначально целевые подходы , основанные были использованы для скрининга лекарственных средств анти- MTB 5, которые не удалось перевести в целые бактериальные клетки. Даже при использовании MTB клетки, она часто выполняется с использованием бульона выращенных культур, которые не точно предсказать эффективность лекарственного средства в естественных условиях 8, 9. Эти проблемы были признаны и скрининга лекарственных препаратов анализы против макрофагов , содержащих MTB или латентную MTB были успешно установлены 8, 10, 11, 12. Тем не менее, даже эти более продвинутые анализы не дают достаточного внимания к проникновению барьеров, что наркотики столкнуться в не васкуляризированных легочных поражений, а в некротических очагов на месте инфекции. В самом деле, Даже для первой линии ТБ рифампицином наркотиков, неоптимальной дозирование была поставлена под сомнение в связи с недостаточным в естественных условиях ткани и спинномозговой жидкости (CSF) проникновение 13, 14, 15, а также снижение эффективности против внутриклеточной Mtb 8, 9. Как таковые, новых моделей и анализов, которые учитывали бы эти параметры в ходе процесса разработки свинца начале будет, несомненно, улучшит ТБ усилия обнаружения наркотиков.
Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно установили недорогой, быстрый, и BSL-2 совместимый альтернативную модель заражения для Mtb наркотиков тестирования 16 эффективности. Эта инфекция модель производится плотно упакованной MTB в крупных макрофагами агрегированных структур, что физиологически соответствующие воспроизводятся барьеры проникновения сотовой связи и порожденных макрофаг-пассировать <eм> Mtb с измененным физиологическим состоянием , напоминающим латентный MTB. Mtb производным от этой инфекции модель была объединена с ресазурин микротитрационного анализа (REMA) , чтобы оценить эффективность препарата, которая производила результаты в соответствии с другими моделями внутриклеточной инфекции и хорошо коррелируют с отчётный способностью общих противотуберкулезных препаратов для достижения высокой концентрации CSF относительно концентрации в сыворотке крови 16.
Здесь мы опишем подробно поколение MTB / макрофагами агрегированных структур для производства макрофаг-пассировать Mtb подходит для тестирования чувствительности к лекарственным препаратам с использованием Рема. В частности, мы покажем, как эта система инфекция может быть адаптирована к формату 96-луночного для совместимости с скрининга кандидатов противотуберкулезных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно описали альтернативную модель MTB инфекции подходит для тестирования эффективности лекарственного средства. Эта модель учитывает два ключевых фактора , которые следует уделять больше внимания в ходе процесса разработки ранней противотуберкулезных препаратов: ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
