Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
Tuberculose (tbc) blijft een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid ondanks de beschikbaarheid van anti-TB chemotherapie regimes voor meer dan 40 jaar 1. Dit is deels te wijten aan de eis voor langere tijd de behandeling van meer dan 6 maanden gebruik van meerdere combinaties van geneesmiddelen, wat leidt tot niet-naleving 2 patiënt. De opkomst van resistente tbc in de afgelopen jaren nog verergerd problemen op een gebied waar de succesvolle ontwikkeling van klinisch goedgekeurde medicijnen is vrijwel non-existent 3. Sterker nog, ondanks uitputtende anti-TB geneesmiddelenontwikkeling slechts één geneesmiddel goedgekeurd door de FDA voor klinisch gebruik in de afgelopen 40 jaar 4. Zo worden nieuwe generaties anti-TB middelen dringend nodig om dit probleem aan te pakken.
Een belangrijk probleem bij tuberculose geneesmiddelen is het gebrek aan succesvolle overdracht uit verbindingen met in vitro activiteit werkzaamheid in de klinische setting= "xref"> 5, 6, 7. Aanvankelijk werden doelwit gebaseerde benaderingen gebruikt om te screenen op anti-Mtb drugs 5, die niet aan te vertalen naar hele bacteriële cellen. Zelfs wanneer Mtb cellen worden gebruikt, wordt vaak uitgevoerd met behulp bouillon gekweekt culturen, die niet nauwkeurig kan voorspellen geneesmiddelefficiëntie in vivo 8, 9. Deze problemen zijn erkend en screeningstesten voor geneesmiddelen tegen macrofagen bevattende Mtb of latente Mtb werden met succes 8, 10, 11, 12. Echter, zelfs deze meer geavanceerde assays onvoldoende rekening met de penetratie barrières drugs tegenkomen in de niet-gevasculariseerd pulmonaire laesies en in de necrotische foci op de plaats van infectie. InderdaadZelfs voor de eerste lijn TB geneesmiddel rifampicine is suboptimale dosering ondervraagd door onvoldoende in vivo weefsel en cerebrospinale vloeistof (CSF) penetratie 13, 14, 15 en verminderde werkzaamheid tegen intracellulaire Mtb 8, 9. Als zodanig, nieuwe modellen en testen die rekening zou houden met deze parameters tijdens het voortouw ontwikkelingsproces vroeg zou ongetwijfeld verbeteren TB drug discovery inspanningen.
Om aan deze behoefte te pakken, hebben we onlangs een goedkope, snelle en BSL-2 compatibele alternatieve infectie model voor MTB werkzaamheid van het geneesmiddel testen 16. Deze infectie model dichtbevolkte geproduceerd gepakt MTB in grote macrofagen aggregaat structuren, die fysiologisch relevante cellulaire penetratie barrières recapituleerde en genereerde macrofaag-gepasseerd <em> MTB met een veranderde fysiologische toestand die lijkt op latente MTB. Mtb afgeleid van deze infectie model werd gecombineerd met de Resazurin microtiter assay (REMA) om de werkzaamheid van geneesmiddelen, waarvan de resultaten in overeenstemming met andere intracellulaire infectie modellen geproduceerd evalueren en goed gecorreleerd met de gerapporteerde vermogen van gemeenschappelijke TB drugs hoge CSF-concentraties ten opzichte van serumconcentraties bereiken 16.
Hier beschrijven we in detail de generatie van MTB / macrofaag aggregaat structuren te produceren macrofaag gepasseerd MTB geschikt voor drug gevoeligheid testen met behulp van REMA. In het bijzonder tonen we hoe deze infectie systeem kan worden aangepast om een 96-well formaat voor compatibiliteit met screening van kandidaat anti-TB-geneesmiddelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we gedetailleerd beschreven alternatieve Mtb infectiemodel geschikt voor drug werkzaamheid testen. Dit model houdt rekening met twee belangrijke factoren die meer rekening moet worden gehouden tijdens de vroege TB geneesmiddelenontwikkelingsproces: de aanwezigheid van fysiologisch relevante barrières voor penetratie van het geneesmiddel en metabolische veranderingen van Mtb tijdens infectie. Terwijl we eerder de voordelen van onze infectie model hebben laten zien en de mogelijkheid van het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
