एक उच्च throughput संगत परख Macrophage passaged के खिलाफ ड्रग प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए<em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
क्षय रोग (टीबी) पर 40 साल के लिए 1 विरोधी टीबी कीमोथेरेपी परहेजों की उपलब्धता के बावजूद एक गंभीर वैश्विक स्वास्थ्य के लिए खतरा बनी हुई है। यह कई दवा संयोजन का उपयोग कर 6 महीने की लंबी अवधि के लिए इलाज की आवश्यकता है, जो गैर-अनुपालन 2 रोगी की ओर जाता है के कारण भाग में है। हाल के वर्षों में दवा प्रतिरोधी टीबी के उद्भव के आगे एक क्षेत्र में समस्याओं बढ़ गया है, जहां चिकित्सकीय अनुमोदित दवाओं के सफल विकास के लगभग न के बराबर 3 है। दरअसल, संपूर्ण विरोधी टीबी दवा के विकास के बावजूद, केवल एक ही दवा की गई है एफडीए पिछले 40 वर्षों में 4 नैदानिक इस्तेमाल के लिए मंजूरी दे दी। इस प्रकार, विरोधी टीबी दवाओं की नई पीढ़ी तत्काल इस समस्या का समाधान करने की जरूरत है।
टीबी दवाओं की खोज में एक प्रमुख समस्या सफल नैदानिक सेटिंग में प्रभावकारिता के लिए इन विट्रो गतिविधि के साथ यौगिकों से हस्तांतरण की कमी है= "xref"> 5, 6, 7। प्रारंभ में, लक्ष्य आधारित दृष्टिकोण विरोधी एमटीबी दवाओं 5, जो पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं में अनुवाद करने में विफल रहा है के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यहां तक कि जब एमटीबी कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं, यह अक्सर शोरबा उगाया संस्कृतियों, जो सही विवो 8, 9 में दवा प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं है का उपयोग किया जाता है। इन समस्याओं को मान्यता दी गई है और एमटीबी या अव्यक्त एमटीबी युक्त मैक्रोफेज के खिलाफ दवा स्क्रीनिंग assays सफलतापूर्वक 8, 10, 11, 12 की स्थापना की गई है। हालांकि, यहां तक कि इन अधिक उन्नत assays प्रवेश बाधाओं कि दवाओं के गैर-vascularized फेफड़े के घावों में मुठभेड़ करने के लिए पर्याप्त ध्यान देना नहीं है, और संक्रमण के स्थल पर परिगलित foci में। वास्तव में, यहां तक कि पहली पंक्ति टीबी दवा रिफैम्पिसिन के लिए, उप इष्टतम खुराक विवो ऊतक और मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (सीएसएफ) में अपर्याप्त होने के कारण पूछताछ की गई है साथ ही 13 प्रवेश, 14, 15 के रूप में intracellular एमटीबी 8, 9 के खिलाफ प्रभावकारिता की कमी हुई। इस तरह, नए मॉडल और assays है कि खाते में शुरुआती बढ़त के विकास की प्रक्रिया के दौरान इन मापदंडों लेने के लिए निस्संदेह टीबी दवाओं की खोज के प्रयासों में सुधार होता है।
इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हमने हाल ही में एक सस्ता, तेजी से, और बीएसएल -2 संगत विकल्प संक्रमण एमटीबी दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए 16 मॉडल की स्थापना की। इस संक्रमण मॉडल घनी का उत्पादन बड़े बृहतभक्षककोशिका कुल संरचनाओं के भीतर एमटीबी पैक, जो physiologically प्रासंगिक सेलुलर प्रवेश बाधाओं recapitulated और उत्पन्न बृहतभक्षककोशिका passaged <eM> अव्यक्त एमटीबी जैसी एक बदल शारीरिक स्थिति के साथ एमटीबी। एमटीबी इस संक्रमण मॉडल से प्राप्त resazurin microtiter परख (REMA) के साथ जोड़ दिया गया था दवा प्रभावकारिता, जो उत्पादन अन्य intracellular संक्रमण मॉडल के साथ संगत परिणामों का मूल्यांकन करने और उच्च सांद्रता सीएसएफ सीरम सांद्रता के सापेक्ष प्राप्त करने के लिए आम टीबी दवाओं की सूचना क्षमता के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध 16।
यहाँ हम विस्तार से एमटीबी / बृहतभक्षककोशिका कुल संरचनाओं की पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए बृहतभक्षककोशिका passaged एमटीबी REMA का उपयोग कर दवा संवेदनशीलता परीक्षण के लिए उपयुक्त वर्णन है। विशेष रूप से, हम बताएंगे कि कैसे इस संक्रमण प्रणाली उम्मीदवार विरोधी टीबी दवाओं के throughput स्क्रीनिंग के साथ संगतता के लिए एक 96 अच्छी तरह प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम विस्तार से वर्णन किया है एक वैकल्पिक एमटीबी संक्रमण दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए उपयुक्त मॉडल। यह मॉडल खाते के दो महत्वपूर्ण कारक है कि जल्दी टीबी दवा के विकास की प्रक्रिया के दौरान अध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
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