En hög kapacitet Kompatibel analys för att utvärdera läkemedlets effektivitet mot makrofag passe<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
Tuberkulos (tbc) är fortfarande ett allvarligt globalt hälsohot trots att det finns anti-TB kemoterapiregimer i över 40 år 1. Detta beror delvis på kravet på långa behandlingstider över 6 månader med hjälp av flera läkemedelskombinationer, vilket leder till patienten inte följs 2. Uppkomsten av läkemedelsresistenta tbc under de senaste åren har förvärras ytterligare problem i ett område där en framgångsrik utveckling av kliniskt godkända läkemedel är så gott som obefintlig 3. Faktum är att trots omfattande anti-TB läkemedelsutveckling har bara ett enda läkemedel varit FDA godkänt för klinisk användning under de senaste 40 åren 4. Således är nya generationer av anti-TB-droger akut behov att lösa detta problem.
Ett centralt problem i TB läkemedelsutveckling är bristen på framgångsrik överföring från föreningar med aktivitet in vitro för effekt i klinisk miljö= "xref"> 5, 6, 7. Inledningsvis var mål baserade metoder som används för att screena för anti-Mtb droger 5, som misslyckades med att översätta till hela bakterieceller. Även när Mtb celler används, är det ofta utförs med användning av buljong odlade kulturer, vilka inte exakt förutsäger läkemedelseffektivitet in vivo 8, 9. Dessa problem har erkänts och drogscreeningsanalyser mot makrofager innehållande Mtb eller latent Mtb har framgångsrikt etablerat 8, 10, 11, 12. Men inte ens dessa mer avancerade analyser inte tillräcklig hänsyn till penetrations hinder som droger möter i de icke-vaskulariserade lungskador, och i den nekrotiska härdar vid infektionsstället. Verkligen, Även för första linjens TB läkemedel rifampicin har suboptimal dosering ifrågasatts på grund av otillräcklig in vivo vävnad och cerebrospinalvätska (CSF) penetration 13, 14, 15 samt minskad effekt mot intracellulära Mtb 8, 9. Som sådan, nya modeller och analyser som skulle ta hänsyn till dessa parametrar under tidig ledning utvecklingsprocessen skulle utan tvekan förbättra TB läkemedelsforskning insatser.
För att lösa detta behov, vi nyligen etablerat en billig, snabb, och BSL-2 kompatibla alternativ infektionsmodell för Mtb läkemedlets effektivitet testning 16. Denna infektion modell produceras tätt packade Mtb inom stora makrofager aggregerade strukturer, som sammanfattat fysiologiskt relevanta cellpenetrationsbarriärer och genererade makrofag-passe <em> Mtb med en förändrad fysiologisk status som liknar latent Mtb. Mtb härrör från denna infektionsmodell kombinerades med resazurin mikro-analys (REMA) för att utvärdera läkemedlets effektivitet, vilket gav resultat som överensstämmer med andra intracellulära infektionsmodeller och korrelerade väl med den rapporterade förmågan hos gemensamma TB-droger för att uppnå hög CSF koncentrationer i förhållande till serumkoncentrationer 16.
Här beskriver vi i detalj generering av MTB / makrofag aggregerade strukturer för att producera makrofag-passe Mtb lämplig för drogresistensbestämning med hjälp av REMA. Framför allt visar vi hur denna infektion system skulle kunna anpassas till en 96-brunnsformat för kompatibilitet med throughput screening av kandidat anti-TB-droger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit i detalj en alternativ Mtb infektionsmodell som lämpar sig för läkemedlets effektivitet testning. Denna modell tar hänsyn till två viktiga faktorer som bör ges mer uppmärksamhet under den tidiga TB läkemedelsutvecklingsprocessen: närvaron av fysiologiskt relevanta hinder för läkemedelspenetration och metabola förändringar av Mtb under infektion. Medan vi tidigare har visat fördelarna med vårt infektionsmodell och föreslog möjligheten att skala upp infektionen för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
