WinCF-modellen - en billig og traktabel mikrokosmos af en slimplugget bronchiole til at studere mikrobiologien af lungeinfektioner
Summary
Slim tilsluttet luftvejene hos cystisk fibrose (CF) patienter er et ideelt miljø for mikrobielle patogener at trives. Manuskriptet beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til at studere CF lunge microbiome i et miljø, der efterligner hvor de forårsager sygdom og hvordan ændringer i kemiske forhold kan køre mikrobielle dynamik.
Abstract
Mange kroniske luftvejssygdomme resulterer i slimplugning af luftvejene. Lunger af en person med cystisk fibrose er et eksempel på tilfælde, hvor deres slimpluggede bronchioler skaber et gunstigt habitat for mikrobiell kolonisering. Forskellige patogener trives i dette miljø interagerer med hinanden og kører mange af symptomerne forbundet med CF sygdom. Ligesom ethvert mikrobielt samfund har de kemiske forhold i deres habitat en betydelig indvirkning på samfundets struktur og dynamik. For eksempel trives forskellige mikroorganismer i forskellige niveauer af ilt eller andre opløste koncentrationer. Dette gælder også i CF lungen, hvor iltkoncentrationer antages at drive samfundsfysiologi og struktur. De her beskrevne metoder er designet til at efterligne lungemiljøet og dyrke patogener på en måde, der ligner det, hvorfra de forårsager sygdom. Manipulation af disse mikrobers kemiske omgivelser bruges til at studere, hvordan kemienStry af lungeinfektioner styrer sin mikrobielle økologi. Metoden, kaldet WinCF-systemet, er baseret på kunstigt sputummedium og smalle kapillærrør, der er beregnet til at tilvejebringe en oxygengradient svarende til den, der findes i slimpluggede bronchioler. Manipulerende kemiske tilstande, såsom mediernes pH i sputumet eller antibiotikapresset, muliggør visualisering af de mikrobiologiske forskelle i disse prøver ved anvendelse af farvede indikatorer, overvågning af gas- eller biofilmproduktion eller ekstraktion og sekventering af nukleinsyreindholdet i hver prøve.
Introduction
Den i dette manuskript metode kaldes WinCF systemet 1. Det overordnede mål med WinCF er at give en forsøgsopstilling i stand til at simulere miljøet i en slim-fyldte lunge bronchiole. Dette vil muliggøre et bearbejdeligt system til at studere mikrobielle patogener af lungesygdomme med en mucus-hypersekretion fænotype herunder cystisk fibrose (CF), kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), astma og andre. Proceduren er designet specielt til studiet af CF, der er kendetegnet ved mutationer, der forårsager lungesekret at blive tyk og svært at klare, vinder påfyldning bronkioler og andre små passager med slim 2. Sådanne blokeringer i lungen inhiberer gasudveksling fordi inhaleret luft er ikke længere i stand til at nå mange alveoler og også give et levested for bakteriel kolonisering 3, 4. Den manglende evne til at forhindre mikrobiel vækst ioverdreven lunge slim sidste ende fører til udvikling af komplekse kroniske infektioner i luftvejene. Disse samfund indeholder en række organismer, herunder vira, svampe og bakterier som Pseudomonas aeruginosa, alle interagere med hinanden 5, 6, 7, 8. Aktiviteten af CF lunge microbiome menes at være involveret i opblussen af symptomer kaldes pulmonale eksacerbationer 1, 9, 10, 11. WinCF muliggør undersøgelse af mikrobielle samfund opførsel omkring disse eksacerbationer og udvides nu til at virke som en base eksperimentelle system til at studere lunge mikrobiel økologi. Traditionelt har forværringer blevet undersøgt ved direkte analyse af prøver udtaget fra lungerne. Mange forstyrrende faktorer gør direkte analyse af mikrobiel bUdfordring i lungerne udfordrer, med WinCF-systemet fjernes mange af disse faktorer, og lungemikrobiets adfærd kan studeres mere direkte, hvilket muliggør en finere analyse af bakteriel aktivitet i en slimplugget bronchiole.
WinCF-systemet giver en metode til at dyrke og analysere bakterier på en måde, der effektivt efterligner lungemiljøet. Traditionelle metoder til dyrkning af lungebakterier involverede ofte dyrkningsprover på traditionelle agarplader. Disse metoder forlader prøverne åbne for atmosfærisk oxygen, idet de forsømmer at tage højde for de hypoxiske og ofte anoxiske tilstande, der findes i lungebronchioler, der er plugget med slim 12 , 13 . Kultivering på agar under aerobiske forhold er intet som CF-lungens miljø og kan vildlede klinikere og forskere vedrørende adfærd hos patogener, som de forsøger at behandle. Derudover er næringsstoffer tilgængelige for bakterier på agarpladerer ulig dem, der findes i selve spyt, som tegner sig for i WinCF ved at udnytte kunstig spyt medier (ASM). Som vist af Pseudomonas kulturer i Sriramulu et al. 14, ASM indeholder et bestemt sæt af komponenter, der efterligner de ressourcer til rådighed for sputum mikrober og også replikerer den fysiske sammenhæng i spyt. Fordi en syg lunge har en specifik microbiome skal undersøgelsen af sådanne mikroorganismer ideelt finde sted i de særlige betingelser i lungerne så godt.
Den WinCF Systemet muliggør hurtig analyse og let manipulation af de eksperimentelle betingelser for at observere mikrobielle ændringer ligner hvordan de ville forekomme i en faktiske lunge bronkiole. Denne teknik muliggør podning af et utal af relaterede prøvetyper herunder sputum, spyt, andre kropssekreter og rene eller blandede bakteriekulturer. Arten af forsøgsopstillingen giver mulighed for øjeblikkelig visuel fortolkning afden mikrobielle samfund adfærd og er designet til at gøre det muligt let nedstrøms anvendelse af et væld af mikrobiologiske og omik procedurer. Sådanne undersøgelser er vigtige, fordi bakterielle ændringer samfund sammensætning baseret på de fysisk-kemiske betingelser for deres omgivelser. Med WinCF de kemiske forhold for medierne kan manipuleres til at analysere virkningerne på bakteriel aktivitet. For eksempel kan surheden af medierne ændres forud for inokulering med en prøve. Efter inkubering kan den bakterielle aktivitet i hver af disse tilstande sammenlignes direkte, og kan drages konklusioner om hvordan bakterier i disse sputumprøver opfører som reaktion på varierende pH. Her har vi skitsere de procedurer for anvendelsen af WinCF systemet og eksempler på, hvordan medierne kemi kan manipuleres til at studere virkningerne på lungerne microbiome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikrobiologiske sminke af en lunge med CF indeholder et stort udvalg af organismer, men betingelserne i lungen har sandsynligvis en betydelig indflydelse på, hvilke typer mikrober der kan overleve og trives 13 , 15 . Specifikke mekanismer, som disse betingelser ændrer sig, og de nøjagtige virkninger, de har på lungemikrobiomet, er generelt uklare i øjeblikket. I denne eksperimentelle metode præsenterer vi en analyse af mikrobiologiske ændringer basere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Vertex Pharmaceuticals og Cystic Fibrosis Research Innovation Award for at finansiere R. Quinn og NIH / NIAID for finansieringstilskud 1 U01 AI124316-01, en systembiologi tilgang til behandling af multidrugs resistente patogener. Vi vil også gerne takke Institut for Mekanik og Aerospace Engineering ved UCSDs bachelorstuderende maskinteknik senior design kursus for at lette samarbejdet med de tekniske aspekter af dette arbejde.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
