Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni
Summary
Le vie respiratorie del flusso mucoso di fibrosi cistica (CF) sono un ambiente ideale per i patogeni microbici a prosperare. Il manoscritto descrive un nuovo metodo per studiare il microbioma polmonare CF in un ambiente che imita dove provocano malattie e come le alterazioni delle condizioni chimiche possano guidare la dinamica microbica.
Abstract
Molte malattie croniche delle vie respiratorie comportano un attacco muco delle vie aeree. I polmoni di un individuo con fibrosi cistica sono un caso esemplare in cui i loro bronchioli collegati a muco creano un habitat favorevole alla colonizzazione microbica. Vari agenti patogeni prosperano in questo ambiente che interagiscono tra loro e guidano molti dei sintomi associati alla malattia di CF. Come tutte le comunità microbiche, le condizioni chimiche del loro habitat hanno un impatto significativo sulla struttura e sulla dinamica della comunità. Ad esempio, diversi microrganismi crescono in livelli diversi di ossigeno o di altre concentrazioni di soluto. Questo è anche vero nel polmone CF, in cui si ritiene che le concentrazioni di ossigeno possano guidare la fisiologia e la struttura comunitaria. I metodi qui descritti sono progettati per simulare l'ambiente polmonare e sviluppare patogeni in un modo più simile a quello da cui provocano malattie. La manipolazione dell'ambiente chimico di questi microbi è poi usata per studiare come i chemiStriato delle infezioni polmonari regola la sua ecologia microbica. Il metodo, chiamato sistema WinCF, si basa su un mezzo artificiale di espettorato e da tubi capillari stretti intesi a fornire un gradiente di ossigeno simile a quello che esiste nei bronchioli a muco. La manipolazione di condizioni chimiche, come il pH media dello spettro o la pressione degli antibiotici, consente di visualizzare le differenze microbiologiche in quei campioni usando indicatori colorati, osservando la produzione di gas o biofilm, oppure estraendo e sequenziando i contenuti dell'acido nucleico di ciascun campione.
Introduction
Il metodo descritto in questo manoscritto è chiamato il sistema WinCF 1 . L'obiettivo generale di WinCF è quello di fornire una configurazione sperimentale in grado di simulare l'ambiente di un bronchiolo polmonare pieno di muco. Ciò consentirà un sistema tracciato per studiare patogeni microbici delle malattie polmonari con un fenotipo di ipersecrezione del muco, tra cui la fibrosi cistica (CF), la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD), l'asma e altri. La procedura è stata progettata appositamente per lo studio del CF, caratterizzato da mutazioni che causano la secrezione polmonare divenuta spessa e difficile da eliminare, eventualmente riempendo bronchioli e altri piccoli passaggi con muco 2 . Tali blocchi nel polmone inibiscono lo scambio di gas perché l'aria inalatoria non è più in grado di raggiungere molti alveoli e fornisce anche un habitat per la colonizzazione batterica 3 , 4 . L'incapacità di prevenire la crescita microbica nelIl muco polmonare eccessivo porta infine allo sviluppo di infezioni croniche complesse della via aerea. Queste comunità contengono una varietà di organismi, inclusi virus, funghi e batteri come Pseudomonas aeruginosa , interagenti tra loro 5 , 6 , 7 , 8 . Si ritiene che l'attività del microbiolo del polmone CF sia coinvolta in flare dei sintomi chiamati exacerbazioni polmonari 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF consente di studiare il comportamento della comunità microbica attorno a queste esacerbazioni ed è ora ampliato per agire come sistema sperimentale di base per studiare l'ecologia microbica del polmone. Tradizionalmente, le esacerbazioni sono state studiate attraverso l'analisi diretta di campioni prelevati dal polmone. Molti fattori confondenti fanno un'analisi diretta del microbiale behavior nei polmoni impegnative, con il sistema WinCF, molti di questi fattori vengono rimossi e il comportamento del microbiome polmone può essere studiato più direttamente, per consentire analisi più fine di attività batterica in un bronchiolo muco-collegato.
Il sistema WinCF fornisce un metodo per crescere e analizzare i batteri in un modo che simula efficacemente l'ambiente polmone. I metodi tradizionali per la coltivazione di batteri polmonari campioni di coltura spesso coinvolti su piastre di agar tradizionali. Questi metodi lasciano i campioni aperti all'ossigeno atmosferico, trascurando per tenere conto del ipossico e condizioni anossiche spesso disponibili a bronchioli polmonari tappati con muco 12, 13. Coltura su agar in condizioni aerobiche è niente come l'ambiente del polmone CF e può trarre in inganno medici e ricercatori sul comportamento degli agenti patogeni che stanno cercando di trattare. Inoltre, le sostanze nutritive disponibili ai batteri su piastre di agarSono dissimili a quelli disponibili nello sputo effettivo, che è rappresentato in WinCF utilizzando l'espansione artificiale (ASM). Come mostrato dalle colture di Pseudomonas in Sriramulu et al. 14 , ASM include un insieme specifico di componenti che imita le risorse disponibili per espellere i microbi e replica anche la consistenza fisica dello sputo. Poiché un polmone malato ha un microbioma specifico, lo studio di tali microrganismi dovrebbe essere idealmente avvenuto anche nelle condizioni specifiche del polmone.
Il sistema WinCF consente un'analisi rapida e una facile manipolazione delle condizioni sperimentali per osservare i cambiamenti microbici simili a come si verificherebbero in un efficace bronchiolo polmonare. Questa tecnica consente l'inoculazione di una miriade di tipi di campioni correlati tra cui sputum, saliva, altre secrezioni corporee e colture batteriche pure o miste. La natura dell'installazione sperimentale consente un'immediata interpretazione visiva diIl comportamento della comunità microbica ed è progettato per consentire una facile applicazione a valle di una moltitudine di procedure microbiologiche e omiche. Tali studi sono importanti perché i cambiamenti della composizione della comunità batterica si basano sulle condizioni fisico-chimiche del loro ambiente. Con WinCF le condizioni chimiche dei media possono essere manipolate per analizzare gli effetti sull'attività batterica. Ad esempio, l'acidità dei supporti può essere modificata prima dell'inoculazione con un campione. Dopo l'incubazione, l'attività batterica in ognuna di queste condizioni può essere confrontata direttamente e si possono trarre conclusioni su come i batteri in questi campioni di sputo si comportino in risposta al pH variabile. Qui descriviamo le procedure per l'applicazione del sistema WinCF e gli esempi di come la chimica dei media può essere manipolata per studiare gli effetti sul microbioma polmonare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trucco microbiologica di un polmone con CF contiene una grande varietà di organismi, ma le condizioni all'interno del polmone probabilmente un'influenza significativa su quali tipi di microbi possono sopravvivere e prosperare 13, 15. specifici meccanismi attraverso i quali queste condizioni cambiano e gli effetti precisi che hanno sul microbioma polmone sono in genere poco chiaro al momento. In questo metodo sperimentale, presentiamo un'analisi d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Vertex Pharmaceuticals e il Premio Innovazione Ricerca Fibrosi Cistica per il finanziamento R. Quinn e il NIH / NIAID per concedere finanziamenti 1 U01 AI124316-01, un approccio di biologia dei sistemi per il trattamento di patogeni resistenti a più farmaci. Vorremmo anche ringraziare il Dipartimento di Meccanica e Ingegneria Aerospaziale presso corso di design di alto livello di ingegneria meccanica di laurea della UCSD per facilitare la collaborazione con gli aspetti ingegneristici di questo lavoro.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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