Das WinCF-Modell - Ein preiswerter und tragbarer Mikrokosmos eines Schleims verstopfte Bronchiole zur Untersuchung der Mikrobiologie von Lungeninfektionen
Summary
Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann.
Abstract
Viele chronische Atemwegserkrankungen führen zu Schleimverschluss der Atemwege. Lungen eines Individuums mit zystischer Fibrose sind ein exemplarischer Fall, bei dem ihre Schleimhautbronchiolen einen günstigen Lebensraum für die mikrobielle Kolonisation schaffen. Verschiedene Pathogene gedeihen in dieser Umgebung, die miteinander interagieren und viele der mit CF-Krankheit assoziierten Symptome antreiben. Wie jede mikrobielle Gemeinschaft haben die chemischen Bedingungen ihres Lebensraumes einen erheblichen Einfluss auf die Gemeinschaftsstruktur und die Dynamik. Beispielsweise gedeihen unterschiedliche Mikroorganismen in unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff oder anderen gelösten Konzentrationen. Dies gilt auch in der CF-Lunge, wo Sauerstoffkonzentrationen geglaubt werden, um die Physiologie und Struktur der Gemeinschaft zu treiben. Die hier beschriebenen Methoden sind so ausgelegt, dass sie die Lungenumgebung nachahmen und die Erreger in einer Weise erhöhen, die derjenigen ähnlich ist, aus der sie eine Krankheit hervorrufen. Manipulation der chemischen Umgebung dieser Mikroben wird dann verwendet, um zu untersuchen, wie die chemistry von Lungeninfektionen regelt seine mikrobielle Ökologie. Das Verfahren, das WinCF System bezeichnet wird, basiert auf künstlichen Sputum Medium und schmalen Kapillarröhrchen bedeutete einen Sauerstoffgradienten bereitzustellen, die ähnlich zu der in Schleim verstopft Bronchiolen existiert. Manipulieren chemische Bedingungen, wie beispielsweise die Medien pH-Wert des Sputums oder Antibiotika Drucks, ermöglicht die Visualisierung der mikrobiologische Unterschiede in den Proben, farbige Indikatoren, die gerade für Gas oder Biofilm-Produktion, oder Extrahieren und die Sequenzierung des Nukleinsäure Inhalts jeder Probe.
Introduction
Die in diesem Manuskript beschriebene Methode heißt das WinCF-System 1 . Das übergeordnete Ziel von WinCF ist es, eine experimentelle Einrichtung zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, die Umgebung eines mit Schleim gefüllten Lungenbronchiole zu simulieren. Dies ermöglicht ein traktierbares System, um mikrobielle Pathogene von Lungenerkrankungen mit einem Schleim-Hypersekretionsphänotyp einschließlich zystischer Fibrose (CF), chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Asthma und anderen zu untersuchen. Das Verfahren wurde speziell für die Untersuchung von CF entwickelt, die durch Mutationen gekennzeichnet ist, die dazu führen, dass Lungensekrete dick und schwer zu klären sind, schließlich füllende Bronchiolen und andere kleine Durchgänge mit Schleim 2 . Solche Blockaden in der Lungen hemmen Gasaustausch, weil inhalierte Luft nicht mehr in der Lage ist, viele Alveolen zu erreichen und auch einen Lebensraum für die Bakterienkolonisation 3 , 4 zu schaffen . Die Unfähigkeit, das mikrobielle Wachstum zu verhindernübermäßige Lunge Schleim führt schließlich zu der Entwicklung von komplexen chronischen Infektionen der Atemwege. Diese Gemeinschaften enthalten eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Viren, Pilze und Bakterien , wie Pseudomonas aeruginosa, die alle in Wechselwirkung miteinander , 5, 6, 7, 8. Die Aktivität der CF Lungen microbiome wird angenommen , in Leuchtsignale von Symptomen pulmonale Exazerbationen 1, 9, 10, 11 genannt beteiligt sein. WinCF ermöglicht Studie der mikrobiellen Gemeinschaft Verhalten rund um diese Exazerbationen und jetzt erweitert wird als Basis experimentelles System zu handeln Lunge mikrobielle Ökologie zu studieren. Traditionell wurden Exazerbationen durch direkte Analyse von Proben aus der Lunge entnommen suchen. Viele Störfaktoren machen direkte Analyse der mikrobiellen bVerhalten in der Lunge herausfordernd, mit dem WinCF-System werden viele dieser Faktoren entfernt und das Verhalten des Lungenmikrobioms kann direkt untersucht werden, was eine feinere Analyse der Bakterienaktivität in einem Schleimhautbronchiole ermöglicht.
Das WinCF-System bietet eine Methode zum Bilden und Analysieren von Bakterien in einer Weise, die die Lungenumgebung effektiv nachahmt. Traditionelle Methoden zum Aufwachsen von Lungenbakterien beteiligten sich oft an der Kultivierung von Proben auf traditionellen Agarplatten. Diese Methoden lassen die Proben dem atmosphärischen Sauerstoff offen und vernachlässigen die hypoxischen und oft anoxischen Zustände bei Lungenbronchiolen, die mit dem Schleim 12 , 13 verbunden sind . Die Kultivierung auf Agar unter aeroben Bedingungen ist nichts wie die Umgebung der CF-Lunge und kann Kliniker und Forscher über das Verhalten der Krankheitserreger, die sie behandeln wollen, irreführen. Zusätzlich sind die Nährstoffe für Bakterien auf Agarplatten erhältlichSind unähnlich zu denen, die in der tatsächlichen Sputum, die in WinCF durch die Verwendung von künstlichen Sputum Medien (ASM) berücksichtigt wird. Wie die Pseudomonas- Kulturen in Sriramulu et al. 14 , ASM enthält einen bestimmten Satz von Komponenten, die die verfügbaren Ressourcen für Sputum-Mikroben nachbildet und auch die physikalische Konsistenz von Sputum repliziert. Weil eine kranke Lunge ein spezifisches Mikrobiom hat, sollte das Studium solcher Mikroorganismen idealerweise auch in den spezifischen Bedingungen der Lunge stattfinden.
Das WinCF-System ermöglicht eine schnelle Analyse und eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen, um mikrobielle Veränderungen zu beobachten, ähnlich wie sie bei einer tatsächlichen Lungenbronchiole auftreten würden. Diese Technik ermöglicht die Inokulation einer Vielzahl von verwandten Probenarten einschließlich Sputum, Speichel, andere Körpersekrete und reine oder gemischte Bakterienkulturen. Die Natur des experimentellen Aufbaus ermöglicht eine sofortige visuelle Interpretation vondas mikrobielle Gemeinschaft Verhalten und ist so konzipiert, leicht nachgeschaltete Anwendung einer Vielzahl von mikrobiologischen und omics Verfahren zu ermöglichen. Solche Studien sind wichtig, weil bakterielle Veränderungen Gemeinschaft Zusammensetzung basierend auf den physikalisch-chemischen Bedingungen ihrer Umwelt. Mit WinCF die chemischen Bedingungen der Medien manipuliert werden, um die Auswirkungen auf die bakterielle Aktivität zu analysieren. Zum Beispiel kann der Säuregehalt der Medien geändert werden, bevor mit einer Probe der Inokulation. Nach der Inkubation kann die bakterielle Aktivität in jedem dieser Bedingungen direkt miteinander verglichen werden und Rückschlüsse darüber, wie Bakterien in diesen Sputum-Proben verhalten sich als Reaktion auf verschiedene pH gezogen werden. Hier erläutern wir die Verfahren zur Anwendung des WinCF System und Beispiele dafür, wie die Medien Chemie manipuliert werden kann, die Auswirkungen auf die Lunge microbiome zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mikrobiologische Make-up einer Lunge mit CF enthält eine Vielzahl von Organismen, aber die Bedingungen innerhalb der Lunge haben wahrscheinlich einen signifikanten Einfluss auf welche Arten von Mikroben überleben und gedeihen können 13 , 15 . Spezifische Mechanismen, durch die sich diese Bedingungen ändern und die genauen Wirkungen auf das Lungenmikrobiom sind im Allgemeinen unklar. In dieser experimentellen Methode stellen wir eine Analyse der mikrobiol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Vertex Pharmaceuticals und den Cystic Fibrosis Research Innovation Award für die Finanzierung von R. Quinn und der NIH / NIAID zur Finanzierung von 1 U01 AI124316-01, einem systembiologischen Ansatz zur Behandlung von Multi-Arzneimittelresistente Pathogenen, anerkennen. Wir danken auch der Abteilung für Mechanische und Luft- und Raumfahrttechnik bei UCSD's Undergraduate Maschinenbau Senior Design Design für die Erleichterung der Zusammenarbeit mit den technischen Aspekten dieser Arbeit.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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