מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות
Summary
דרכי הנשימה המחוברות לריר של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF) הן סביבה אידיאלית לפטוגנים חיידקים לשגשג. כתב היד מתאר שיטה חדשה לחקר מיקרוביום הריאות CF בסביבה שבה מחקה את המחלה, וכיצד שינויים בתנאים כימיים יכולים להניע דינמיקה מיקרוביאלית.
Abstract
מחלות כרוניות רבות בדרכי הנשימה גורמות לחיבור רירי של דרכי הנשימה. הריאות של אדם עם סיסטיק פיברוזיס הם דוגמה למופת שבו bronchioles שלהם ריר מחוברות ליצור בית גידול נוחים עבור קולוניזציה חיידקים. פתוגנים שונים לשגשג בסביבה זו אינטראקציה זה עם זה נהיגה רבים של סימפטומים הקשורים למחלת CF. כמו כל קהילה מיקרוביאלית, התנאים הכימיים של בית הגידול שלהם משפיעים באופן משמעותי על מבנה הקהילה ועל הדינמיקה. לדוגמה, מיקרואורגניזמים שונים לשגשג ברמות שונות של חמצן או ריכוזי מומס אחרים. זה נכון גם ריאות CF, שבו ריכוזי החמצן הם האמינו לנהוג פיזיולוגיה הקהילה ומבנה. השיטות המתוארות כאן נועדו לחקות את סביבת הריאות ולגדל פתוגנים באופן דומה יותר לזה שממנו הם גורמים למחלה. מניפולציה של הסביבה הכימית של חיידקים אלה משמשת כדי ללמוד כיצד chemistry של דלקות ריאות מסדיר אקולוגיה מיקרוביאלית שלה. השיטה, המכונה מערכת WinCF, מבוסס על מדיום כיח מלאכותי וצינורות נימי צר נועדו לספק שיפוע חמצן דומה לזה קיים bronchioles פקוק ריר. מניפולצית תנאים כימיים, כגון pH התקשורת של לחץ כיח או אנטיביוטיקה, מאפשר ויזואליזציה של הבדלי מיקרוביולוגית בדגימות אלה באמצעות מחוונים בצבע, צופים לייצור גז או ביופילם, או לחילוץ וסדר תכול חומצות הגרעין של כל דגימה.
Introduction
השיטה המתוארת בכתב היד הזה נקראת מערכת WinCF 1. המטרה הכללית של WinCF היא לספק סביבת ניסוי מסוגל לדמות את הסביבה של bronchiole ריאות מלאות ריר. זה יאפשר למערכת צייתנית ללמוד פתוגנים חיידקים של מחלות ריאה עם פנוטיפ ריר הפרשה המוגבר כולל סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה ועוד. ההליך תוכנן במיוחד עבור המחקר של CF, אשר מאופיין על ידי מוטציות הגורמות פרשות ריאה להיות עבות וקשה לנקות, בסופו של דבר מילוי bronchioles ומעברים קטנים אחרים עם ריר 2. חסימות כאלה ריאות לעכב חילוף הגזים בגלל באוויר שאנו נושמים הוא כבר לא מסוגל להגיע alveoli רבות גם לספק בית גידול קולוניזציה חיידקית 3, 4. חוסר היכולת למנוע התפתחותם של חיידקים בתוךריר ריאות מוגזם בסופו של דבר מוביל לפיתוח של זיהומים כרוניים מורכבים של דרכי הנשימה. קהילות אלה מכילות מגוון של אורגניזמים, כולל וירוסים, פטריות וחיידקים כמו Pseudomonas aeruginosa , כל אינטראקציה זה עם זה 5 , 6 , 7 , 8 . הפעילות של מיקרוביום ריאה CF הוא האמין להיות מעורב בהתלקחויות של סימפטומים הנקראים החמרות ריאתי 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF מאפשר ללמוד את ההתנהגות של הקהילה המיקרוביאלית סביב החמרות אלה, ועכשיו הוא מורחב כדי לשמש מערכת ניסיונית בסיס ללמוד אקולוגיה הריאות של הריאות. באופן מסורתי, החריפות נחקרו באמצעות ניתוח ישיר של דגימות נלקח מן הריאה. גורמים רבים מבלבלים לעשות ניתוח ישיר של מיקרוביאלית בehavior בריאותיו מאתגרות, עם מערכת WinCF, רבי הגורמים הללו יוסרו ואת ההתנהגות של Microbiome הריאות ניתן ללמוד באופן ישיר יותר, המאפשרת ניתוח מדויק יותר של פעילות חיידקים בתוך bronchiole לחשמל-ריר.
מערכת WinCF מספקת שיטה לגדל ולנתח חיידקים באופן אשר מחק באופן יעיל את סביבת הריאות. שיטות מסורתיות חיידקי ריאות גדלים קרובות דגימות culturing מעורבות על צלחות אגרו מסורתיות. שיטות אלה לעזוב את הדגימות פתוחות חמצן אטמוספרי, מזניחות לתת דין וחשבון על היפוקסי ולעתים קרובות בתנאי anoxic למצוא bronchioles ריאות פקוקים עם ריר 12, 13. Culturing על אגרת בתנאים אירוביים דבר כמו הסביבה של ריאות CF והוא יכול להטעות קלינאים וחוקרים בנוגע להתנהגות של פתוגנים כי הם מנסים לטפל. בנוסף, החומרים המזינים לרשות חיידקים על צלחות אגראינם דומים לאלה זמינים כיח בפועל, אשר היוו בשנת WinCF ידי ניצול תקשורת כיח מלאכותית (ASM). כפי שניתן לראות על ידי תרבויות Pseudomonas ב Sriramulu ואח. 14, ASM כולל קבוצה מסוימת של רכיבים המחקה את המשאבים העומדים לרשות חיידקי ליחה גם משכפלת את העקביות הפיסית של ליחה. מכיוון ריאה חולה יש Microbiome ספציפי, המחקר של מיקרואורגניזמים כאלה רצוי מתקיימים התנאים הספציפיים של הריאות גם כן.
המערכת מאפשרת WinCF ניתוח מהיר מניפולציה קלה של תנאי הניסוי לבחון שינויים מיקרוביאליים בדומה לאופן בו הם יתרחשו באופן bronchiole ריאות בפועל. טכניקה זו מאפשרת לחיסון של מספר עצום של סוגי מדגם הקשורים כוללים ליחה, רוק, הפרשות גוף אחרות ותרבויות חיידקים טהורות או מעורבות. האופי של הגדרת הניסוי מאפשר פרשנות חזותית ברורה שלהתנהגות הקהילה מיקרוביאלית נועד לאפשר יישום במורד הזרם קל של מספר רב של הליכים מיקרוביולוגיים ואומיקים. מחקרים כאלה חשובים משום שהרכב הקהילה הבקטריאלית משתנה בהתאם לתנאים הפיזיו-כימיים של סביבתם. עם WinCF התנאים הכימיים של התקשורת יכול להיות מניפולציה כדי לנתח את ההשפעות על פעילות חיידקית. לדוגמה, חומציות של התקשורת ניתן לשנות לפני חיסון עם מדגם. לאחר הדגירה, ניתן להשוות את הפעילות החיידקית בכל אחד מהמצבים הללו באופן ישיר, ומסקנות ניתן להסיק כיצד חיידקים באותם דגימות כיחיים מתנהגים בתגובה ל- pH משתנה. כאן, אנו מתווים את הנהלים ליישום מערכת WinCF ודוגמאות כיצד ניתן להשפיע על הכימיה התקשורתית כדי לחקור את ההשפעות על המיקרוביום הריאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האיפור המיקרוביולוגי של ריאה עם CF מכיל מגוון רחב של אורגניזמים, אבל התנאים בתוך הריאה סביר להניח השפעה משמעותית על מה סוגים של חיידקים יכולים לשרוד ולשגשג 13 , 15 . מנגנונים ספציפיים שדרכם משתנים התנאים הללו והאפקטים המדויקים שיש להם על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ורטקס תרופות ופרס חדשנות מחקר סיסטיק פיברוזיס למימון ר קווין ו- NIH / NIAID עבור 1 מענק מימון U01 AI124316-01, גישה ביולוגיה מערכתית לטיפול של פתוגנים עמידים רב-סמים. אנחנו גם רוצים להודות במחלקה מכונות להנדסת אווירונוטיקה וחלל כמובן עיצוב מכני הנדסי בכיר לתואר ראשון של UCSD עבור הקלת בשיתוף עם היבטים הנדסיים של העבודה הזאת.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
