WinCF-modellen - En billig och tålbar mikrokosmos av en slimkopplad bronkiol för att studera mikrobiologin av lunginfektioner
Summary
Slemmet inkopplad luftvägarna hos cystisk fibros (CF) patienter är en idealisk miljö för mikrobiella patogener att frodas. Manuskriptet beskriver en ny metod för att studera CF lung microbiome i en miljö som efterliknar där de orsakar sjukdom och hur förändringar av kemiska förhållanden kan driva mikrobiella dynamik.
Abstract
Många kroniska luftvägssjukdomar resulterar i slem pluggning av luftvägarna. Lungor hos en individ med cystisk fibros är en exempelfall där deras slem-ansluten bronkioler skapa en gynnsam miljö för mikrobiell kolonisering. Olika patogener trivs i denna miljö interagerar med varandra och driver många av de symptom som förknippas med CF sjukdom. Liksom alla mikrobiella, kemiska villkoren för deras livsmiljö har en betydande inverkan på samhällsstrukturen och dynamik. Till exempel, olika mikroorganismer trivs i olika nivåer av syre eller andra lösta koncentrationer. Detta är också sant i CF lungan, där syrekoncentrationer tros driva samhälls fysiologi och struktur. De metoder som beskrivs här är utformade för att efterlikna lungmiljön och växa patogener på ett sätt som mer liknar den från vilken de orsakar sjukdom. Manipulation av de kemiska omgivningarna dessa mikrober används sedan för att studera hur kemiStryk av lunginfektioner styr sin mikrobiella ekologi. Metoden, som kallas WinCF-systemet, är baserat på artificiellt sputummedium och smala kapillärrör som är avsedda att tillhandahålla en syregradient liknande den som finns i slemkopplade bronkioler. Manipulerande kemiska förhållanden, såsom media-pH hos sputumet eller antibiotikatrycket, möjliggör visualisering av de mikrobiologiska skillnaderna i dessa prover genom att använda färgade indikatorer, titta på gas eller biofilmproduktion eller extrahera och sekvensera nukleinsyrainnehållet i varje prov.
Introduction
Metoden som beskrivs i detta manuskript kallas WinCF-systemet 1 . Det övergripande målet med WinCF är att tillhandahålla en experimentell inställning som kan simulera miljön hos en slem-fylld lungbronkiol. Detta kommer att möjliggöra ett töjbart system för att studera mikrobiella patogener av lungsjukdomar med en hypotesekretionsfenotyp inklusive cystisk fibros (CF), kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD), astma och andra. Förfarandet utformades specifikt för studien av CF, som kännetecknas av mutationer som orsakar lungsekretioner att bli tjocka och svåra att klara, slutligen fylla bronkioler och andra små passager med slem 2 . Sådana blockeringar i lunginhiberande gasutbyte eftersom inhalerad luft inte längre kan nå många alveoler och också ger ett livsmiljö för bakteriell kolonisering 3 , 4 . Oförmågan att förhindra mikrobiell tillväxt idriven lunga slem leder så småningom till utvecklingen av komplexa kroniska infektioner i luftvägarna. Dessa samhällen innehåller en mängd olika organismer, inklusive virus, svampar och bakterier som Pseudomonas aeruginosa, alla interagera med varandra 5, 6, 7, 8. Aktiviteten av den CF lung microbiome tros vara involverad i uppblossning av symptom som kallas lung exacerbationer 1, 9, 10, 11. WinCF möjliggör studier av mikrobiella beteendet kring dessa exacerbationer och nu utökas för att fungera som en bas experimentellt system för att studera lung mikrobiell ekologi. Traditionellt har exacerbationer studerats genom direkt analys av prover tagna från lungan. Många störande faktorer gör direkt analys av mikrobiell Behavior i lungorna utmanande, med WinCF systemet, många av dessa faktorer tas bort och kan studeras beteendet av lungan microbiome mer direkt, vilket möjliggör finare analys av bakteriell aktivitet i ett slem-inkopplad bronkiol.
Den WinCF systemet tillhandahåller ett förfarande för att växa och analysera bakterier på ett sätt som effektivt efterliknar lungan miljön. Traditionella metoder för odling lung bakterier ofta involverade odling prover på traditionella agarplattor. Dessa metoder lämnar proverna öppet för atmosfäriskt syre, försummar att ta hänsyn till den hypoxiska och ofta anoxiska betingelser funna i lung bronkioler pluggade med slem 12, 13. Odling på agar under aeroba förhållanden är inget som miljön i CF lungan och kan vilseleda kliniker och forskare om beteendet hos de patogener som de försöker att behandla. Dessutom de näringsämnen som finns tillgängliga för bakterier på agarplattorär olika till de som är tillgängliga i själva sputum, som redovisas i WinCF genom utnyttjande artificiell sputum media (ASM). Såsom visas av de Pseudomonas-kulturer i Sriramulu et al. 14, ASM innehåller en särskild uppsättning komponenter som efterliknar de resurser som finns tillgängliga för sputum mikrober och även replikerar den fysikaliska konsistensen hos sputum. Eftersom en sjuk lunga har en specifik microbiome bör studiet av sådana mikroorganismer helst ske i de särskilda villkoren i lungan samt.
Det WinCF systemet möjliggör snabb analys och enkel hantering av de experimentella förhållandena för att observera mikrobiella förändringar som liknar hur de skulle uppträda i en verklig lunga bronchiole. Denna teknik gör det möjligt att inokulering av en myriad av relaterade provtyper inklusive sputum, saliv, andra kroppssekret och rena eller blandade bakteriekulturer. Den typ av experimentuppställning möjliggör omedelbar visuell tolkning avden mikrobiella beteende och är utformad för att möjliggöra enkel nedströms tillämpning av en mängd mikrobiologiska och liknande områden förfaranden. Sådana studier är viktiga eftersom bakterie förändringar gemenskap komposition baserad på de fysiokemiska villkoren för deras omgivning. Med WinCF de kemiska villkoren i media kan manipuleras för att analysera effekterna på bakteriell aktivitet. Till exempel, kan surheten hos medierna ändras före inokulering med ett prov. Efter inkubation, kan den bakteriella aktiviteten i vart och ett av dessa tillstånd direkt jämföras, och slutsatser kan dras om hur bakterier i dessa sputumprover beter som svar på varierande pH. Här har vi beskriva de förfaranden för tillämpning av WinCF systemet och exempel på hur media kemi kan manipuleras för att studera effekterna på lung microbiome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikrobiologiska sminken av en lunga med CF innehåller en stor mängd organismer, men tillstånden i lungan har sannolikt ett betydande inflytande på vilka typer av mikrober som kan överleva och trivas 13 , 15 . Specifika mekanismer genom vilka dessa förhållanden förändras och de exakta effekterna de har på lungmikrobiomen är i allmänhet oklara för närvarande. I denna experimentella metod presenterar vi en analys av mikrobiologiska förändringar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Vertex Pharmaceuticals och cystisk fibros Research Innovation Award för finansiering R. Quinn och NIH / NIAID finansiering bidrag 1 U01 AI124316-01, en systembiologi strategi för behandling av multiresistenta patogener. Vi vill också tacka Institutionen för mekanik och flygteknik på UCSD grundutbildning maskinteknik senior design kurs för att underlätta samarbetet med verkstads aspekterna av detta arbete.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
