In vitro- metoder til sammenligning af målbinding og CDC-induktion mellem terapeutiske antistoffer: applikationer i biosimilaritetsanalyse

Summary

Denne protokol beskriver in vitro sammenligning af to centrale funktionelle egenskaber af rituximab: targetbindende og komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC) induktion. Metoderne blev anvendt til en side-til-side sammenligning mellem henvisning rituximab og en rituximab biosimilært. Disse assays kan anvendes under biosimilar udvikling eller som en kvalitetskontrol i deres produktion.

Abstract

Terapeutiske monoklonale antistoffer (mAb'er) er relevante for behandlingen af ​​forskellige patologier, herunder cancere. Udviklingen af ​​biosimilære monoklonale antistoffer af farmaceutiske virksomheder er en mulighed på markedet, men det er også en strategi for at øge narkotika tilgængelighed og reducere terapi-associerede omkostninger. Protokollerne beskrevet her beskriver evalueringen af ​​målbindingsmedlemmet og CDC induktion ved rituximab i Daudi-celler. Disse to funktioner kræver forskellige strukturelle regioner af antistoffet og er relevante for den kliniske virkning induceret af rituximab. Protokollerne tillader side-til-side sammenligning af en reference rituximab og et markedsført rituximab biosimilært. De evaluerede produkter viste forskelle i såvel targetbindende og CDC induktion, hvilket antyder, at der er underliggende fysisk-kemiske forskelle og understreger behovet for at analysere virkningerne af disse forskelle i kliniske omgivelser. Metoderne rapporteret her udgør enkel og billig in vitro </ Em> modeller til evaluering af aktiviteten af ​​rituximabbiosimilarer. Således kan de være nyttige under biosimilar udvikling, såvel som for kvalitetskontrol i biosimilar produktion. Desuden kan de fremlagte metoder ekstrapoleres til andre terapeutiske mAb'er.

Introduction

Terapeutiske antistoffer er rekombinante monoklonale antistoffer (mAbs) udviklet til behandling af forskellige patologier, herunder kræftformer, autoimmune og kroniske sygdomme, neurologiske lidelser og andre ¹ . FDA har i øjeblikket godkendt mere end 40 terapeutiske mAbs, og flere forventes at nå markedet i de følgende år.

Rituximab er et high-affinitet kimært monoklonalt IgG1 antistof godkendt til behandling af CD20 ⁺ B-celle ikke-Hodgkins lymfom (NHL), CD20 ⁺ follikulært NHL, kronisk lymfocytisk leukæmi og reumatoid arthritis ^{2 , 3} . Anerkendelsen af ​​CD20, som er overudtrykt i B-celler, ved rituximab inducerer apoptose; Komplement aktivering; Og antistofafhængig celle-medieret cytotoksicitet (ADCC) ³ . Patenterne af dette lægemiddel udløb i Europa og i USA i 2013 og 2016, henholdsvis. Således udvikler farmaceutiske virksomheder verden over rituximabbiosimilarer. Som i ethvert andet stof til konsum kræver biosimilarer godkendelse fra reguleringsorganer. Internationale retningslinjer tyder på, at biosimilaritet for mAbs skal påvises ved at sammenligne de fysisk-kemiske egenskaber, farmakokinetik, effektivitet og sikkerhed for de nye og referenceprodukter ⁴ .

Følgelig må de metoder, der anvendes i sådanne sammenligninger, vurdere de strukturelle og funktionelle egenskaber af mAb'erne, især dem med klinisk relevans. Til dette formål viser in vitro- analyser flere fordele i forhold til in vivo eksperimenter (gennemgået i Chapman et al. ) ⁵ : i) in vitro- undersøgelser er mere følsomme for forskelle mellem de foreslåede biosimilar og referenceproduktet; Ii) in vivo undersøgelser skal udføres i relevante arter, som for mange mAbs erprimater; og iii), da virkningsmekanismen, den prækliniske toksikologi, og de kliniske virkninger af referenceproduktet er velkendte, in vivo studier med biosimilars måske ikke giver yderligere nyttige oplysninger. I overensstemmelse hermed Den Europæiske Unions Vejledning til biosimilars giver kandidater til at indtaste kliniske forsøg baseret på solide in vitro-data alene ^6.

Her præsenterer vi to hurtige, økonomiske og enkle analyser, der evaluerer den biologiske aktivitet af rituximab hjælp CD20 ⁺ dyrkede celler. Disse assays kan indgå som en del af sammenligneligheden øvelse for rituximab bioækvivalente kandidater.

Protocol

1. Evaluering af målbindingen ved flowcytometri Fremstilling af biologiske materialer og reagenser Lav 500 ml RPMI dyrkningsmedium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (H-IFBS). Kultur Daudi Burkitts lymfom (Daudi) celler og Daudi GFP + -celler under anvendelse af RPMI og 75 cm2 kulturflasker. Oprethold kulturerne ved 37 ° C i en 5% CO 2 fugtet atmosfære indtil de når 6 – 9 x 10 5 celler / ml. Lav 50 ml farvn…

Representative Results

Under anvendelse af de ovenfor beskrevne protokoller målbinding og CDC induktion af henvisning rituximab blev sammenlignet parallelt med dem for et biosimilært rituximab fremstillet og kommercielt tilgængelige i Asien. I Daudi-celler, begge mAb'er bundet CD20 i en koncentrationsafhængig måde (figur 1D). Ikke-lineære regressionsanalyse af bindingsdata vist en r2 af 0,978 og 0,848 for refere…

Discussion

Patentudløbet af et terapeutisk mAb fremmer udviklingen af ​​biosimilars. Således er der et behov for enkle metoder, der kan identificere forskelle i klinisk relevante aktiviteter af disse produkter. CD20 ⁺ dyrkede celler blev anvendt til evaluering af to vigtige funktionelle egenskaber rituximab: targetbindende og CDC induktion. Den tidligere aktivitet kræver anerkendelse af CD20 af Fab-området af mAb'et, mens sidstnævnte afhænger hovedsageligt af interaktionen af Fc-regionen med dets komplemen…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.