Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

Summary

Este protocolo descreve a comparação in vitro de duas características funcionais chave de rituximab: ligação ao alvo e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de indução. Os métodos foram utilizados para uma comparação lado-a-lado entre o rituximab referência e um biossimilar rituximab. Estes ensaios podem ser empregues durante o desenvolvimento biológico similar, ou como um controlo de qualidade na sua produção.

Abstract

Os anticorpos monoclonais (mAbs) terapêuticas são relevantes para o tratamento de diversas patologias, incluindo cancros. O desenvolvimento de mAbs biossimilares pelas empresas farmacêuticas é uma oportunidade de mercado, mas também é uma estratégia para aumentar a acessibilidade de drogas e reduzir os custos associados de terapia. Os protocolos detalhados aqui descrever a avaliação da ligação ao alvo e a indução por CDC rituximab em células Daudi. Estas duas funções requerem diferentes regiões estruturais do anticorpo e são relevantes para o efeito clínico induzido pelo rituximab. Os protocolos permitem a comparação lado-a-lado de uma rituximab referência e um biossimilar rituximab comercializado. Os produtos avaliados apresentaram diferenças tanto na ligação ao alvo e indução CDC, sugerindo que existem diferenças físico-químicas subjacentes e destacando a necessidade de analisar o impacto de tais diferenças no ambiente clínico. Os métodos aqui apresentados constituem simples e barato in vitro </ Em> para a avaliação da atividade dos biossimilares de rituximab. Assim, podem ser úteis durante o desenvolvimento biossimilar, bem como para o controle de qualidade na produção biosimilar. Além disso, os métodos apresentados podem ser extrapolados para outros mAb terapêuticos.

Introduction

Os anticorpos terapêuticos são anticorpos monoclonais recombinantes (mAbs) desenvolvidos para o tratamento de diferentes patologias, incluindo cancros, doenças autoimunes e crónicas, distúrbios neurológicos e outros ¹ . Atualmente, a FDA concedeu a aprovação de mais de 40 mAbs terapêuticos, e mais se espera que cheguem ao mercado nos anos seguintes.

Rituximab é um anticorpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidade aprovado para o tratamento de linfoma não Hodgkin de células B CD20 ⁺ (NHL), LNH folicular CD20 ⁺ , leucemia linfocítica crónica e artrite reumatóide ^{2 , 3} . O reconhecimento de CD20, que é sobre-expresso em células B, pelo rituximab induz apoptose; Ativação do complemento; E citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ³ . As patentes desta droga expiraram na Europa e nos EUA em 2013 e 2016, Respectivamente. Assim, as empresas farmacêuticas em todo o mundo estão desenvolvendo rituximab biosimilares. Como em qualquer outro medicamento para consumo humano, biosimilares requerem aprovação de agências reguladoras. As diretrizes internacionais indicam que, para os mAbs, a biosimilaridade deve ser demonstrada através da comparação das características físico-químicas, farmacocinéticas, eficácia e segurança dos produtos novos e de referência ⁴ .

Consequentemente, as metodologias utilizadas nestas comparações devem avaliar as características estruturais e funcionais dos mAb, especialmente aqueles com relevância clínica. Para este fim, os ensaios in vitro mostram várias vantagens em relação às experiências in vivo (revisto em Chapman et al. ) ⁵ : i) os estudos in vitro são mais sensíveis às diferenças entre o biosimilar proposto eo produto de referência; Ii) estudos in vivo devem ser realizados em espécies relevantes, o que para muitos mAbs éprimatas não-humanos; e iii) uma vez que o mecanismo de acção, a toxicologia pré-clínicos, e os efeitos clínicos do produto de referência são bem conhecidas, em estudos in vivo com biosimilars pode não fornecer informação útil adicional. Assim, a orientação da União Europeia para biosimilares permite que os candidatos a entrar ensaios clínicos com base em robusta dados in vitro sozinho ^6.

Aqui, apresentamos dois ensaios rápidos, econômicos e simples que avaliam a atividade biológica do rituximab usando células cultivadas CD20 ^+. Estes ensaios podem ser incluídos como parte do exercício de comparabilidade para os candidatos biossimilares rituximab.

Protocol

1. Avaliação da ligação alvo por citometria de fluxo Preparação de materiais biológicos e reagentes Preparar 500 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor (H-IFBS). Cultura Daudi Burkitt Linfoma (Daudi) células e Daudi GFP + células utilizando RPMI e 75 cm 2 cultura frascos. Manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2 até atingir 6 – 9 x 10 5 células / mL. <…

Representative Results

Utilizando os protocolos descritos acima, a ligação de alvo e a indução de CDC do rituximab de referência foram comparadas em paralelo com as de um rituximab biosimilar produzido e comercialmente disponível na Ásia. Em c�ulas de Daudi, ambos mAbs ligaram CD20 de uma forma dependente da concentra�o ( Figura 1D ). As regressões não-lineares dos dados de ligação mostraram um r 2 de…

Discussion

A expiração da patente de um mAb terapêutico está a promover o desenvolvimento de biosimilares. Assim, existe a necessidade de métodos simples que possam identificar diferenças nas actividades clinicamente relevantes destes produtos. Utilizaram-se células cultivadas com CD20 ⁺ para a avaliação de duas características funcionais chave do rituximab: ligação ao alvo e indução de CDC. A actividade anterior requer o reconhecimento de CD20 pela região Fab do mAb, enquanto a última depende principalm…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.