一种直接从一滴血液中快速中性粒细胞趋化分析的片上方法
Summary
本文提供了通过在单个微流体芯片上整合来自全血的片上嗜中性粒细胞分离和趋化性测试来进行快速嗜中性粒细胞趋化性测定的详细方法。
Abstract
嗜中性粒细胞迁移和趋化性对我们身体的免疫系统至关重要。微流控装置越来越多地用于调查嗜中性粒细胞迁移和趋化性，因为它们具有实时可视化，精确控制化学浓度梯度产生以及降低的试剂和样品消耗的优点。最近，微流体研究人员正在越来越多地努力开发直接从全血中开发整合且易于操作的微流体趋化性分析系统。在这个方向上，第一个全芯片方法被开发用于整合嗜中性粒细胞的磁性负性纯化和来自小血容量样品的趋化性测定。这种新方法允许在25分钟内快速进行样品至结果嗜中性粒细胞趋化性测试。在本文中，我们提供了详细的构建，操作和数据分析方法，用于片上趋化性测定，讨论故障排除策略，limi重点和未来发展方向。显示了使用这种全芯片方法测试定义的化学引诱物， N-甲基-Mult-Leu-Phe（fMLP）和来自慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的痰的中性粒细胞趋化性测定的代表性结果。该方法适用于许多细胞迁移相关调查和临床应用。
Introduction
趋化因子是一种有针对性的细胞迁移到可溶性化学物质浓度梯度的过程，在很多生物学过程中都是非常重要的，包括免疫反应1,2,3 ，组织发育4和癌症转移5 。嗜中性粒细胞是最丰富的白细胞亚群，在使身体的先天宿主防御功能以及介导适应性免疫反应6,7中发挥关键作用。嗜中性粒细胞配备有高度调节的趋化机制，允许这些运动免疫细胞通过化学疗法8对病原体衍生的化学引诱物（ 例如 fMLP）和宿主衍生的化学引诱物（ 例如白细胞介素-8）作出反应。嗜中性粒细胞迁移和趋化性介导各种生理问题和疾病如炎症和癌症1,9 。因此，准确评估嗜中性粒细胞趋化性为研究嗜中性粒细胞生物学和相关疾病提供了重要的功能读数。
与广泛使用的常规趋化性测定（ 例如 transwell测定10 ）相比，由于精确控制的化学梯度产生和小型化，微流控装置显示出对定量评估细胞迁移和趋化性的巨大前景11,12,13 。在过去二十年左右，已经开发出各种微流体装置来研究不同生物细胞类型，特别是中性粒细胞11的趋化性。大量的努力是用于描述时空复合物中嗜中性粒细胞迁移的特征配置在微流体装置14,15中的液晶梯度。还开发了有趣的策略来研究使用微流体装置的嗜中性粒细胞的定向决策16。从生物学方面研究，微流体装置的应用已经扩展到临床样本用于疾病评估17,18,19 。然而，许多微流体装置的使用仅限于专门的研究实验室，并且需要从大量血液样品中获得长时间的嗜中性粒细胞分离。因此，直接从一滴全血20,21,22 ，ef“> 23,24。
朝着这个方向，开发了一种全面的片上方法，其将磁性中性粒细胞纯化和随后的趋化性测定整合到单个微流体装置25上 。这种全片式方法具有以下新颖的特征：1）与以前的片上策略相比，通过基于粘附的细胞捕获或基于细胞大小的滤波来分离嗜中性粒细胞20,22 ，这种新方法允许高纯度，中性粒细胞与小体积全血的片上磁分离，以及化学诱导剂刺激时的趋化性测量; 2）细胞对接结构有助于使嗜中性粒细胞的初始位置靠近化学梯度通道，并允许简单的趋化性分析，而无需单细胞追踪; 3）中和粒细胞分离和chemot的整合在单个微流体装置上的轴测定允许在实验步骤之间没有中断的25分钟内快速的样品 – 结果趋化性分析。
本文提供了一个详细的协议，用于这种全片式趋化性测定的构建，操作和数据分析方法。该文件证明了通过测试已知的重组化学引诱物和来自患者的复杂趋化性样品来进行中性粒细胞趋化性的开发方法的有效使用，随后关于故障排除策略，限制和未来方向的讨论。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，描述了在单个微流体芯片上直接从全血中分离嗜中性粒细胞并进行趋化性试验的详细方案。该方法易于操作，阴性选择高纯度中性粒细胞，快速样品至结果趋化性测试，减少试剂和样品消耗，以及精确的细胞迁移数据分析，提供了有用的功能。粗略估计，来自输入全血样本的嗜中性粒细胞的至少25％有效地进入装置中的对接结构，并且通过片上吉姆萨染色发现嗜中性粒细胞纯度高。
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分得到加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的资助。感谢温尼伯维多利亚维多利亚综合医院和温尼伯七橡综合医院临床应用研究与教育研究所，负责管理人类临床样本。我们感谢Hagit Peretz-Soroka博士有关测定操作策略的有益讨论。 我们非常感谢滑铁卢大学的卡罗琳教授和陈晓明博士在拍摄过程中的慷慨支持。
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
