Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed
Summary
Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.
Abstract
Neutrofiele migratie en chemotaxis zijn cruciaal voor het immuunsysteem van ons lichaam. Microfluidische apparaten worden steeds meer gebruikt om neutrofiele migratie en chemotaxis te onderzoeken vanwege hun voordelen in real-time visualisatie, nauwkeurige controle van de chemische concentratiegradiëntgeneratie en verminderde reagentia en het gebruik van monsters. Onlangs is door de microfluidische onderzoekers een groeiende inspanning gedaan voor het ontwikkelen van geïntegreerde en gemakkelijk geëxploiteerde microfluïdische chemotaxis-analysesystemen, direct uit het gehele bloed. In deze richting werd de eerste all-on-chip methode ontwikkeld voor het integreren van de magnetische negatieve zuivering van neutrofielen en de chemotaxis assay uit kleine bloedvolume monsters. Deze nieuwe methode maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle neutrofiele chemotaxis-test te testen. In dit document bieden we gedetailleerde constructie, werking en data analyse methode voor deze all-on-chip chemotaxis assay met een discussie over probleemoplossing strategieën, limiTations en toekomstige richtingen. Representatieve resultaten van de neutrofiele chemotaxis-test die een gedefinieerde chemoattractant, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) en sputum van een patiënt met chronische obstructieve longziekte (COPD) testen met behulp van deze all-on-chip methode, worden getest. Deze methode is van toepassing op veel cel migratie gerelateerde onderzoeken en klinische toepassingen.
Introduction
Chemotaxis, een proces van gerichte celmigratie naar oplosbaar chemisch concentratiegradiënt, is kritisch betrokken bij vele biologische processen, waaronder immuunrespons 1 , 2 , 3 , weefselontwikkeling 4 en kankermetastase 5 . Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcel subset en spelen cruciale rollen om het lichaam de aangeboren gastheerverdedigingfuncties mogelijk te maken, evenals bij het bemiddelen van adaptieve immuunresponsen 6 , 7 . Neutrofielen zijn uitgerust met sterk gereguleerde chemotactische machines waardoor deze motiele immuuncellen kunnen reageren op zowel pathogeen afgeleide chemoattractanten ( bv. FMLP) en gastheer-afgeleide chemoattractanten ( bijv . Interleukine-8) throughchemotaxis 8 . Neutrofiele migratie en chemotaxis mediëren verschillende fysiologische problemenEn ziekten zoals ontsteking en kanker 1 , 9 . Zo geeft de nauwkeurige beoordeling van neutrofiele chemotaxis een belangrijke functionele uitlezing voor het bestuderen van de neutrofiele biologie en de bijbehorende ziekten.
In vergelijking met de veelgebruikte conventionele chemotaxis assays ( bijv. Transwell assay 10 ) tonen de microfluïdische inrichtingen een grote belofte voor kwantitatieve evaluatie van celmigratie en chemotaxis door de nauwkeurig gecontroleerde chemische gradiëntgeneratie en miniaturisatie 11 , 12 , 13 . In de afgelopen twee decennia of zo zijn diverse microfluïdische apparaten ontwikkeld om de chemotaxis van verschillende biologische celsoorten, vooral neutrofielen 11 , te bestuderen. Er was aanzienlijke inspanning gewijd aan het karakteriseren van neutrofiele migratie in spatiotemporally complex che Mische gradiënten die werden geconfigureerd in de microfluïdische inrichtingen 14 , 15 . Interessante strategieën werden ook ontwikkeld om directionele besluitvorming door neutrofielen te bepalen door gebruik te maken van de microfluïdische inrichtingen 16. Naast biologisch georiënteerd onderzoek zijn de toepassingen van microfluïdische apparaten uitgebreid naar testklinische monsters voor ziekte-evaluatie 17 , 18 , 19 . Het gebruik van veel microfluïdische apparaten is echter beperkt tot gespecialiseerde onderzoekslaboratoria en vereist langdurige neutrofiele isolatie van groot volume bloedmonsters. Daarom is er een groeiende trend geweest voor het ontwikkelen van geïntegreerde microfluïdische apparaten voor snelle neutrofiele chemotaxis-analyse direct vanuit een druppel bloed in het bloed 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
Naar deze richting werd een all-on-chip methode ontwikkeld die de magnetische negatieve neutrofielzuivering en de daaropvolgende chemotaxis-analyse op een enkele microfluidische inrichting 25 integreert. Deze all-on-chip methode heeft de volgende nieuwe kenmerken: 1) in tegenstelling tot eerdere on-chip strategieën die neutrofielen van het bloed isoleren door middel van adhesie-gebaseerde celopname of op celgrootte gebaseerde filtering 20 , 22 , maakt deze nieuwe methode hoge Zuiverheid, on-chip magnetische scheiding van de neutrofielen uit kleine volumes van volledig bloed, evenals chemotaxis meting bij chemoattractant stimulatie; 2) de celdockstructuur helpt de initiële posities van de neutrofielen dicht bij het chemische gradiëntkanaal af te stemmen en maakt een eenvoudige chemotaxisanalyse mogelijk zonder enkelvoudige cellen te volgen; 3) de integratie van de neutrofiele isolatie en chemotAs assay op een enkel microfluïdisch apparaat maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle analyse van de chemotaxis op de proef te krijgen, wanneer er geen onderbreking is tussen de experimentele stappen.
Dit papier bevat een gedetailleerd protocol voor de constructie, werking en data analyse methode van deze all-on-chip chemotaxis assay. Het papier toont het effectieve gebruik van de ontwikkelde methode voor het uitvoeren van neutrofiele chemotaxis door een bekende recombinant chemoattractant en complexe chemotactische monsters van patiënten te testen, gevolgd door een discussie over probleemoplossingsstrategieën, beperkingen en toekomstige richtingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit document is een gedetailleerd protocol beschreven om neutrofielen direct uit het bloed te isoleren, gevolgd door de chemotaxis test, alles op een enkele microfluïdische chip. Deze methode biedt handige functies in zijn gemakkelijke werking, negatieve selectie van neutrofielen met hoge zuiverheid, snelle test van chemotaxis, resultaatvermindering, verminderde reagentia en steekproefverbruik en nauwkeurige analyse van de celmigratie. Als een ruwe schatting heeft tenminste 25% van de neutrofielen van het input-gehe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada (NSERC) en de Canadese Instituten voor Gezondheidsonderzoek (CIHR). Wij bedanken het Clinical Institute of Applied Research and Education in het Victoria General Hospital in Winnipeg en Seven Oaks General Hospital in Winnipeg voor het beheer van klinische monsters van mensen. We danken Dr. Hagit Peretz-Soroka voor een goede discussie over de analysestrategieën. We bedanken professor Carolyn Ren en dr. Xiaoming (Cody) Chen van de Universiteit van Waterloo voor hun royale steun in het filmproces.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
