En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe
Summary
Denna artikel tillhandahåller den detaljerade metoden för att utföra en snabb neutrofil-kemotaxisanalys genom att integrera den neutrofila isolationen på chip från helblod och kemotaxistestet på en enda mikrofluidisk chip.
Abstract
Neutrofil migration och kemotax är kritiska för vår kropps immunsystem. Mikrofluidiska enheter används alltmer för att undersöka neutrofilmigration och kemotaxor på grund av deras fördelar i realtidsvisualisering, exakt kontroll av kemisk koncentrationsgradientgenerering och minskad reagens- och provförbrukning. Nyligen har mikrofluidiska forskare gjort en ökande insats för att utveckla integrerade och lättanvända mikrofluidiska kemotaxisanalyssystem, direkt från helblod. I denna riktning utvecklades den första all-on-chip-metoden för att integrera den magnetiska negativa reningen av neutrofiler och kemotaxisanalysen från små blodvolymprover. Denna nya metod medger ett snabbt prov-till-resultat neutrofilt kemotaxistest på 25 min. I det här dokumentet tillhandahåller vi detaljerad konstruktion, drift och data analysmetod för denna allt-på-chip kemotaxis analys med en diskussion om felsökningsstrategier, limiTationer och framtida riktningar. Representativa resultat av den neutrofila kemotaxisanalys som testar en definierad kemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) och sputum från en patient med kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) med användning av denna all-on-chip-metod visas. Denna metod är tillämplig på många cellmigrationsrelaterade undersökningar och kliniska tillämpningar.
Introduction
Chemotaxis, en process med riktad cellmigrering till löslig kemisk koncentrationsgradient, är kritiskt inblandad i många biologiska förfaranden inklusive immunsvar 1 , 2 , 3 , vävnadsutveckling 4 och cancermetastas 5 . Neutrofiler är den vanligaste vita blodkroppsuppsättningen och spelar viktiga roller för att möjliggöra kroppens medfödda värdförsvarsfunktioner, samt för att förmedla adaptiva immunsvar 6 , 7 . Neutrofiler är utrustade med högreglerade kemotaktiska maskiner vilket gör att dessa motila immunceller kan reagera på både patogen-härledda kemoattraktanter ( t.ex. fMLP) och värd-härledda kemoattraktanter ( t.ex. interleukin-8) genomkemotaxis 8 . Neutrofil migration och kemotaxi medlar olika fysiologiska problemOch sjukdomar som inflammation och cancer 1 , 9 . Således ger den exakta bedömningen av neutrofilkemotaxis en viktig funktionell avläsning för att studera neutrofilbiologin och de associerade sjukdomarna.
Jämfört med de allmänt använda konventionella kemotaxisanalyserna (t ex transwellanalys 10 ) visar de mikrofluidiska anordningarna ett stort löfte för kvantitativ utvärdering av cellmigration och kemotax på grund av den exakt kontrollerade kemiska gradientgenereringen och miniatyriseringen 11 , 12 , 13 . Under de senaste två decennierna har olika mikrofluidiska anordningar utvecklats för att studera kemotaxis av olika biologiska celltyper, speciellt neutrofiler 11 . Betydande ansträngningar ägnades åt att karakterisera neutrofilmigration i spatiotemporalt komplexa che Mical gradienter som konfigurerades i de mikrofluidiska anordningarna 14 , 15 . Intressanta strategier utvecklades också för att studera riktningsbeslutande av neutrofiler med användning av de mikrofluidiska enheterna 16. Förutom biologisk orienterad forskning har tillämpningarna av mikrofluidiska anordningar utökats till testkliniska prover för utvärdering av sjukdomar 17 , 18 , 19 . Användningen av många mikrofluidiska anordningar är emellertid begränsad till specialiserade forskningslaboratorier och kräver långvarig neutrofilisolering från stor volym blodprover. Därför har det varit en växande trend att utveckla integrerade mikrofluidiska enheter för snabb analys av neutrofilkemotaxier direkt från en helblodsfall 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
Mot denna riktning utvecklades en all-on-chip-metod som integrerar den magnetiska negativa neutrofila reningen och den efterföljande kemotaxisanalysen på en enda mikrofluidisk anordning 25 . Denna all-on-chip-metod har följande nya egenskaper: 1) Till skillnad från tidigare strategier på chip som isolerar neutrofiler från blodet genom vidhäftningsbaserad cellinfångning eller cellstorleksbaserad filtrering 20 , 22 tillåter denna nya metod hög Renhet, magnetisk separation på chipet av neutrofilerna från små volymer av helblod, liksom kemotaxismätning vid kemoattraktantstimulering; 2) celldockningsstrukturen hjälper till att justera de ursprungliga positionerna hos neutrofilerna nära kemisk gradientkanal och tillåter enkel kemotaxanalys utan singelcellspårning; 3) integrationen av neutrofilisolering och kemotAxelanalysen på en enda mikrofluidisk anordning tillåter snabb analys till resultat av kemotaxisanalys på 25 minuter när det inte uppstår något avbrott mellan försöksstegen.
Detta papper ger ett detaljerat protokoll för konstruktion, drift och data analysmetod för denna all-on-chip chemotaxis analys. Papperet demonstrerar effektiv användning av den utvecklade metoden för att utföra neutrofilkemotaxi genom att testa ett känt rekombinant kemoattraktant och komplexa kemotaktiska prover från patienter, följt av en diskussion om felsökningsstrategier, begränsningar och framtida riktningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta dokument beskrivs ett detaljerat protokoll för direkt isolering av neutrofiler från helblod följt av kemotaxistestet, allt på ett enda mikrofluidiskt chip. Denna metod erbjuder användbara funktioner i sin lätta operation, negativt urval av neutrofiler med hög renhet, snabbt prov-till-resultat-kemotaxistest, reducerade reagenser och provkonsumtion och exakt cellmigrationsdataanalys. Som en grov uppskattning kom minst 25% av neutrofilerna från det ingående helblodprovet effektivt in i dockningsstrukturen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av bidrag från Canadian Science and Engineering Research Council (NSERC) och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (CIHR). Vi tackar det kliniska institutet för tillämpad forskning och utbildning vid Victoria General Hospital i Winnipeg och Seven Oaks General Hospital i Winnipeg för att hantera kliniska prover från mänskliga ämnen. Vi tackar Dr. Hagit Peretz-Soroka för en bra diskussion om analysoperationsstrategierna. Vi tackar professor Carolyn Ren och Dr. Xiaoming (Cody) Chen från University of Waterloo för deras generösa stöd i filmprocessen.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
