LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics
Summary
Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.
Abstract
Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.
Introduction
Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste 1 einführt. Diese Modifikation während Asn – Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4 verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidierung von Gln – Reste die isomeren gamma-Glutaminsäure (γ-Glu) und alpha-glutaminsäure – Isoformen (α-Glu) bei einem erwarteten 1: 7 Verhältnis 3, 5, aber dieses Verhältnis kann durch die Wirkung der verschoben werden das ubiquitäre Enzym Transglutaminase 2 und andere Transglutaminasen, einschließlich Transglutaminase 1, wird eine Enzyme kürzlich mit extrazellulären Vesikeln im Gehirn 6 als assoziiert identifiziert.
Der Ursprung der Desamidierung kann entweder spontan oder enzymatisch sein, ist das erstere besonders häufig auf Gln – Resten , bei denen Transglutaminasen und anderen Enzyme vermitteln inter / intramolekulare Vernetzung über Umamidierung (siehe 3 für weitere Details über Gln Umamidierung und ihre Auswirkungen in einigen chronischen und tödliche Krankheiten beim Menschen). Daher ist Desamidierung ein PTM , die eine entscheidende Auswirkung auf die Struktur und Funktion der betroffenen Moleküle 4, 7, 8 und erfordert eine eingehende chemische Charakterisierung 3 im Lichte ihrer unterschiedlichen biochemischen Konsequenzen einschließlich der Dienst als molekulare Uhr hat 9 des Alterns .
Obwohl Deamidierung von Asn-Reste hat relativ gut charakterisierte von unten nach oben shotgun Proteomics 1, 10, Deamidierung von Gln – Resten immer noch nicht eine geeignete Charakterisierungsmethode über die anspruchsvolle Analyse von Modellverbindungen , die durch elektronen basierend hat radikale Fragmentierungs 11. Wir haben vor kurzem eine neue eindimensional Shotgun Proteomics Strategie (LERLIC-MS / MS) 3 , die Trennung von Gln und Asn Desamidierung Isoformen von komplexen biologischen Proben und Modellverbindungen in einer einzigen Analyse ermöglicht. LERLIC-MS / MS basiert auf der Trennung von tryptischen Peptiden verdaute eine lange Länge (50 cm) Ionenaustauschersäule (LAX) arbeitet auf elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie (Erlić) Modus und mit dem Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS / MS). Diese neue analytische Strategie wurde verwendet, um das Ausmaß jeder deamidiertes Rückstand in menschlichen Hirngewebe zu charakterisieren und relativ zu Quantifizierenf "> 3. Dennoch skizzierte das Protokoll hier wird Video – Imaging von LERLIC-MS / MS abzielen , die Besonderheiten von Protein Desamidierung im biochemischen Zusammenhang von Interesse zu studieren.
ETHIK STATEMENT
Alle Verfahren dieses Protokolls wurden von der Institutional Review Board der Nanyang Technological University in Singapur und wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts genehmigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt – Protokoll von LERLIC-MS / MS 3 wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung – Chromatographie (Erlić) <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15) unterstützt wird, National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0.003-2.016) und NTU-NHG Alternsforschung Grant ( Grant-ARG / 14017). Wir möchten unsere Dankbarkeit und aufrichtigsten Dank an Dr. Andrew Alpert und PolyLC Team zum Ausdruck bringen für haben uns freundlicherweise mit den Verpackungsmaterialien, die möglich diese Studie gemacht.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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