LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica
Summary
Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.
Abstract
Caracterización de la desamidación de proteínas es imprescindible para descifrar el papel (s) y las potencialidades de esta modificación postraduccional de proteínas (PTM) en la patología humana y otros contextos bioquímicos. Para llevar a cabo la caracterización de la desamidación de proteínas, hemos desarrollado recientemente una novela de longitud larga electrostática interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem repulsión-hidrófilo (LERLIC-MS / MS) método que puede separar la glutamina (Gln) y asparagina isoforma (Asn) productos de desamidación de compuestos modelo a muestras biológicas muy compleja. LERLIC-MS / MS es, por lo tanto, la primera estrategia proteómica escopeta para la separación y cuantificación de las isoformas de desamidación de Gln. También demostramos, como novedad, que el protocolo de procesamiento de muestras descrito aquí estabiliza el intermedio de succinimida que permite su caracterización por LERLIC-MS / MS. Aplicación de LERLIC-MS / MS, como se muestra en este artículo de vídeo puede ayudar a dilucidar el momento desconocidaarrays n moleculares de desamidación de proteínas. Además, LERLIC-MS / MS proporciona una mayor comprensión de las reacciones enzimáticas que abarcan la desamidación en fondos biológicas distintas.
Introduction
La desamidación es una modificación postraduccional de proteínas (PTM) que introduce una carga negativa a la cadena principal de proteína a través de la modificación de la asparagina (Asn) y / o residuos de glutamina (Gln) 1. Esta modificación mientras que afecta a los residuos de Asn genera el ácido isoaspártico productos isómeros (isoAsp) y N ácido aspártico (Asp) a una común relación 3: 1 2. No obstante, esta relación puede ser alterado por la intervención de la enzima de reparación metiltransferasa-L isoaspartilo (PIMT) 3, 4. Del mismo modo, la desamidación de los residuos de Gln genera el ácido isomérica-gamma glutámico (γ-Glu) y las isoformas de ácido alfa-glutámico (α-Glu) a una esperada proporción de 1: 3, 5 7, pero esta relación puede ser desplazado por la acción de la transglutaminasa omnipresente enzima 2 y otras transglutaminasas, incluyendo transglutaminasa 1, un correonzyme identificado recientemente como asociada con vesículas extracelulares en el cerebro 6.
El origen de la desamidación puede ser ya sea espontánea o enzimática, el primero es especialmente común en los residuos de Gln en la que transglutaminasas y otras enzimas median reticulación / intra-molecular entre a través de transamidación (ver 3 para más detalles sobre Gln transamidación y sus implicaciones en varios crónica y enfermedades humanas mortales). Por lo tanto, la desamidación es una PTM que tiene una repercusión fundamental en la estructura y función de las moléculas afectadas 4, 7, 8 y requiere de una caracterización química en profundidad 3 a la luz de sus diversas consecuencias bioquímicas incluyendo su servicio de reloj como molecular del envejecimiento 9 .
Aunque la desamidación de residuos de Asn ha sido relativamente bien caracterizado por la proteómica escopeta de abajo hacia arriba 1, 10, desamidación de residuos de Gln todavía no tiene un método de caracterización adecuada más allá del análisis desafiante de compuestos modelo por la fragmentación radical a base de electrones 11. Recientemente hemos desarrollado un novedoso de una sola dimensión estrategia proteómica escopeta (LERLIC-MS / MS) 3 que permite la separación de Gln y Asn isoformas de desamidación partir de muestras biológicas complejas y compuestos modelo en un solo análisis. LERLIC-MS / MS se basa en la separación de trípticos digeridos péptidos usando una larga de longitud (50 cm) columna de intercambio iónico (LAX) que trabaja en el modo de cromatografía de interacción electrostática de repulsión-hidrófilo (ERLIC) y acoplada a espectrometría de masas tándem (LC- MS / MS). Esta nueva estrategia de análisis se ha utilizado para caracterizar y relativamente cuantificar la extensión de cada residuo desamidada en los tejidos cerebrales humanosf "> 3. Sin embargo, el protocolo descrito aquí proporcionará imágenes de vídeo de LERLIC-MS / MS dirigido a estudiar las peculiaridades de la desamidación de proteínas en el contexto bioquímico de interés.
DECLARACIÓN DE ÉTICA
Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad Tecnológica de Nanyang en Singapur y se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este video-artículo se presenta un protocolo paso a paso de LERLIC-MS / MS 3, un método para llevar a cabo la caracterización en profundidad y para determinar con precisión la extensión de la desamidación de proteínas y los procesos enzimáticos que participan en esta modificación de la proteína. LERLIC-MS / MS se basa en el uso de una de longitud larga (50 cm) LAX bajo el principio de cromatografía electrostática de repulsión-hidrófilo interacción (ERLIC) 27.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Educación de Singapur (Nivel 2: Grant ARC9 / 15), Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur (NMRC-DE-GRI-0003 hasta 2016), y el NTU-NHG Aging Research Grant ( subvención ARG / 14017). Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento y más sincero agradecimiento al Dr. Andrew Alpert y equipo para PolyLC amablemente nos proporcionó los materiales de embalaje que hicieron posible este estudio.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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