LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics
Summary
Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.
Abstract
Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.
Introduction
A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) 1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) 3, 4. Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o ácido isomérica gama-glutâmico (γ-Glu) e isoformas de ácido alfa-glutâmico (α-Glu) a uma esperada razão de 1: 7 3, 5, mas esta proporção pode ser deslocado por acção de a transglutaminase ubíqua enzima 2 e outras transglutaminases, incluindo uma transglutaminase, uma mensagemnzyme recentemente identificada como associada com vesículas extracelulares no cérebro 6.
A origem de desamidação pode ser espontânea ou enzimática, o primeiro é especialmente comum em resíduos de Gln em que as transglutaminases e outras enzimas medeiam reticulação / intra-molecular entre através de transamidação (ver 3 para mais detalhes sobre Gln transamidação e suas implicações em várias crónica e doenças humanas fatais). Portanto, desamidação é um PTM que tem uma repercussão crucial sobre a estrutura e função das moléculas afectadas 4, 7, 8 e requer uma caracterização química em profundidade 3 em função das suas diversas consequências bioquímicas incluindo o seu serviço de relógio como molecular de envelhecimento 9 .
Embora desamidação de resíduos Asn tem sido relativamente bem caracterizados por proteómica espingarda de baixo para cima 1, 10, desamidação de resíduos Gln ainda não tem um método de caracterização adequada para além da análise de um desafio por compostos modelo à base de electrões fragmentação radical 11. Nós desenvolvemos recentemente um novo uma dimensão proteómica espingarda estratégia (LERLIC-MS / MS) 3 que permite a separação de Gln e Asn isoformas de desamidação em amostras biológicas complexas e compostos modelo em uma única análise. LERLIC-MS / MS baseia-se na separação de péptidos trípticos digerido usando um longo comprimento (50 cm) de coluna de permuta iónica (LAX) que trabalha no modo de cromatografia de interacção electrostática repulsão-hidrofílico (ERLIC) e acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC- MS / MS). Esta nova estratégia de análise foi usado para caracterizar e quantificar relativamente a extensão de cada resíduo desamidada nos tecidos cerebrais humanosf "> 3. No entanto, o protocolo delineado aqui vai fornecer imagens de vídeo de LERLIC-MS / MS visa estudar as peculiaridades de desamidação proteína no contexto bioquímica de interesse.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA
Todos os procedimentos deste protocolo ter sido aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Tecnológica de Nanyang, em Cingapura e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS 3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) 27. A utilização de um…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi em parte apoiado por subsídios do Ministério da Educação de Cingapura (Tier 2: Conceder ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) e NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão e mais sinceros agradecimentos ao Dr. Andrew Alpert e equipe PolyLC para gentilmente nos cedeu os materiais de embalagem que tornaram possível este estudo.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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