Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden. Dette er en roman metode som gjør det mulig for første gang kvantifisering og karakterisering av glutamin og asparagin deamideringsseter isoformer av hagle proteomikk.
Karakterisering av protein deamidering er viktig å dechiffrere rollen (e) og potensialene til dette proteinet posttranslasjonell modifikasjon (PTM) i humane patologi, og andre biokjemiske sammenhenger. For å utføre karakterisering av protein deamidering, har vi nylig utviklet en ny lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden som kan skille glutamin (Gin) og asparagin (Asn) isoform produkter av deamidering fra modellforbindelser for å svært komplekse biologiske prøver. LERLIC-MS / MS er derfor den første hagle proteomforskning strategi for separasjon og kvantifisering av GLN deamideringsseter isoformer. Vi viser også, som en nyhet, at prøvebehandlingsprotokollen beskrevet her stabiliserer succinimidet mellomliggende tillater dens karakterisering av LERLIC-MS / MS. Bruk av LERLIC-MS / MS som vist i denne videoen artikkelen kan bidra til å belyse tiden unknown molekylære sammensetninger av protein deamidering. I tillegg gir LERLIC-MS / MS ytterligere forståelse av de enzymatiske reaksjoner som omfatter deamidering i forskjellige biologiske bakgrunn.
Deamidering er et protein posttranslasjonell modifikasjon (PTM) som innfører en negativ ladning til selve proteinryggraden gjennom modifikasjon av asparagin (Asn) og / eller glutamin (Gin) residier 1. Denne modifikasjon mens påvirker Asn-restene genererer isomere produkter isoaspartic syre (isoAsp) og n-asparaginsyre (Asp) ved et felles forholdet 3: 1 2. Ikke desto mindre kan dette forhold endres ved intervensjon av reparasjon enzymet L-isoaspartyl metyltransferase (PIMT) 3, 4. På lignende måte, deamidering av Gln-rester genererer isomere gamma-glutaminsyre (γ-Glu) og alfa-glutaminsyre-isoformer (α-Glu) til en forventet 1: 7-forhold 3, 5, men dette forhold kan forskyves ved virkningen av den allestedsnærværende enzymet transglutaminase 2 og andre transglutaminases, inkludert transglutaminase en, en enzyme nylig identifisert som assosiert med ekstracellulære vesikler i hjernen 6.
Opprinnelsen av deamidering kan enten være spontan eller enzymatisk, den førstnevnte er spesielt vanlig på Gln-rester i hvilke transglutaminases og andre enzymer som medierer den inter / intra-molekylære tverrbinding via transamidering (se 3 for nærmere informasjon om Gln transamidering og dens konsekvenser i flere kroniske og dødelige sykdommer hos mennesker). Derfor er deamideringen en PTM som har en avgjørende ettervirkning på strukturen og funksjonen til berørte molekyler 4, 7, 8 og krever en grundig kjemisk karakterisering 3 i lys av dens forskjellige biokjemiske konsekvenser med sin tjeneste som molekylære klokke av aldring 9 .
Selv om deamidering av Asn-restene har vært forholdsvis godt karakterisert ved nedenfra og opp hagle proteomforskning 1, 10, deamidering av Gln-rester fremdeles ikke har en passende karakteristikk metode utover utfordrende analyse av modellforbindelser ved elektron-radikal fragmentering 11. Vi har nylig utviklet en ny ett-dimensjon hagle proteomforskning strategi (LERLIC-MS / MS) 3 som muliggjør separasjon av Gin og Asn deamideringsseter isoformer fra komplekse biologiske prøver og modell-forbindelser i en enkelt analyse. LERLIC-MS / MS er basert på separasjon av tryptiske peptider nedbrytes ved hjelp av en lang lengde (50 cm) ionebytterkolonne (SFO) arbeider på modus elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) og koplet til tandem massespektrometri (LC MS / MS). Denne nye analyse strategi har blitt brukt for å karakterisere og forholdsvis kvantifisere utstrekningen av hver isoaspartatholdig rest i menneskelige hjernen vevf "> 3. Ikke desto mindre vil protokollen beskrevet her gi videobilder av LERLIC-MS / MS forsøkte å studere de særegenheter protein deamidering i den biokjemiske forbindelse av interesse.
ETIKK ERKLÆRING
Alle prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Institutional Review Board av Nanyang Technological University i Singapore, og er utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer.
I denne video-artikkelen presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for LERLIC-MS / MS 3, en fremgangsmåte utføre grundig karakterisering og for nøyaktig å bestemme graden av protein deamidering og de enzymatiske prosesser som er involvert i denne proteinmodifisering. LERLIC-MS / MS er basert på bruken av en lang lengde (50 cm) LAX henhold til prinsippet om elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) 27. Bruken av en lang lengde kolonne…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016), og NTU-NHG Aging stipend ( Grant ARG / 14017). Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet og mest oppriktige takk til Dr. Andrew Alpert og PolyLC team for vennlig gitt oss med den originale emballasjen gjort mulig denne studien.
PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |