LERLIC-MS / MS för Djupgående Karakterisering och kvantifiering av glutamin och asparagin Deamidering i Shotgun proteomik
Summary
Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll av den lång längd elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktionskromatografi-tandemmasspektrometri metoden (LERLIC-MS / MS). Detta är en ny metod som gör det möjligt för första gången kvantifiering och karakterisering av glutamin och asparagin deamidering isoformer genom shotgun proteomics.
Abstract
Karaktärisering av protein deamidering är absolut nödvändigt att dechiffrera roll (er) och möjligheter av detta protein posttranslationell modifiering (PTM) i human patologi och andra biokemiska sammanhang. För att utföra karaktärisering av protein deamidering, har vi nyligen utvecklat en ny lång längd elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktionskromatografi-tandemmasspektrometri (LERLIC-MS / MS) metod som kan separera den glutamin (Gin) och asparagin (Asn) isoform produkterna av deamidering från modellföreningar för att mycket komplexa biologiska prover. LERLIC-MS / MS är därför den första hagelgevär proteomik strategi för separation och kvantifiering av Gin deamidering isoformer. Vi visar också, som en nyhet, att provet bearbetning protokoll som beskrivs här stabiliserar succinimid mellanliggande tillåter dess karakterisering av LERLIC-MS / MS. Tillämpning av LERLIC-MS / MS som visas i denna video artikeln kan bidra till att belysa den aktuella unknown molekylära kedjor av protein deamidering. Dessutom ger LERLIC-MS / MS ytterligare förståelse av de enzymatiska reaktioner som omfattar deamidering i distinkta biologiska bakgrunder.
Introduction
Deamidering är ett protein posttranslationell modifiering (PTM) som introducerar en negativ laddning till proteinet ryggraden genom modifiering av asparagin (Asn) och / eller glutamin (Gin) resterna 1. Denna modifikation samtidigt som de påverkar Asn-rester genererar isomera produkterna isoasparaginsyra (isoAsp) och n -asparaginsyra (Asp) vid en gemensam 3: 1-förhållande 2. Utan hinder, kan detta förhållande ändras genom ingripandet av reparation enzymet L-isoaspartyl metyltransferas (PIMT) 3, 4. På liknande sätt, deamidering av Gin-rester genererar den isomera gamma-glutaminsyra (γ-Glu) och alfa-glutaminsyra isoformer (α-Glu) vid en förväntad 1: 7-förhållande 3, 5, men detta förhållande kan förskjutas genom verkan av den allestädes närvarande enzym transglutaminas 2 och andra transglutaminaser, inklusive transglutaminas 1, ett enzyme nyligen identifierats som associerade med extracellulära vesiklar i hjärnan 6.
Ursprunget för deamidering kan vara antingen spontan eller enzymatisk, den förra är särskilt vanligt på Gin-rester i vilka transglutaminaser och andra enzymer medierar inter / intra-molekylär tvärbindning via transamidering (se 3 för ytterligare detaljer om Gin transamidering och dess konsekvenser i flera kroniska och dödliga sjukdomar hos människan). Därför är deamidering en PTM som har en avgörande återverkan på strukturen och funktionen av påverkade molekyler 4, 7, 8 och kräver en fördjupad kemisk karakterisering 3 mot bakgrund av dess olika biokemiska konsekvenser inklusive dess tjänst som molekylärt klocka av åldrande 9 .
Även deamidering av Asn rester har varit relativt väl kännetecknas av bottom-up-hagelgevär proteomik 1, 10, deamidering av Gin-rester ändå inte har en lämplig karakterisering metod bortom den utmanande analys av modellföreningar genom elektronbaserad radikal fragmentering 11. Vi har nyligen utvecklat en ny en-dimensionen shotgun proteomics strategi (LERLIC-MS / MS) 3 som möjliggör separation av Gin och Asn deamidering isoformer från komplexa biologiska prover och modellföreningar i en enda analys. LERLIC-MS / MS är baserad på separationen av tryptiska digere peptider med användning av en lång längd (50 cm) jonbyteskolonn (LAX) arbetar på elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktions-kromatografi (ERLIC) läge och kopplad till tandemmasspektrometri (LC- MS / MS). Denna nya analytiska strategi har använts för att karaktärisera och relativt kvantifiera omfattningen av varje deamiderade rest i humana hjärnvävnaderf "> 3. Trots det kommer det protokoll som beskrivs här ger video avbildning av LERLIC-MS / MS syftar att studera egenheter protein deamidering i den biokemiska sammanhang av intresse.
ETIK ANALYS
Alla förfaranden i detta protokoll har godkänts av Institutional Review Board i Nanyang Technological University i Singapore och har utförts i enlighet med de institutionella riktlinjerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna video-artikeln presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för LERLIC-MS / MS-3, till en metod att utföra en fördjupad karakterisering och för att noggrant bestämma graden av protein deamidering och de enzymatiska processer involverade i denna proteinmodifiering. LERLIC-MS / MS är baserad på användningen av en lång längd (50 cm) LAX enligt principen om elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktions-kromatografi (ERLIC) 27. Användning av en kolonn med lån…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete delvis finansierats med bidrag från Singapore undervisningsministeriet (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) och NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Vi vill uttrycka vår tacksamhet och mest uppriktiga tack till Dr. Andrew Alpert och PolyLC team för vänligt försett oss med förpackningsmaterial som möjliggjort denna studie.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
