Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إعداد الأدوية العشبية: إير-زيان ديكوتيون و إير-زيان التي تحتوي على مصل ل Published: May 31, 2017 doi: 10.3791/55654
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2The Academy of Integrative Medicine of Fudan University

Summary

هنا، نقدم إعداد مغلي إشيان (إكسد) في أربع خطوات، تمرغ، مغلي، والترشيح، والتركيز، وإظهار إدارة مصل يحتوي على إكسد المحضرة إلى الفئران. هذه الأساليب قابلة للتطبيق على الجسم الحي وفي دراسة المختبر من الاستغناء العشبية مثل الأدوية الصينية التقليدية.

Abstract

وقد حظيت الأدوية العشبية التقليدية، وهي طب بديل في الإطار السريري، باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. قبل التسليم إلى الجسم، وعادة ما يتطلب إجراء استخراج إضافية للافراج عن المكونات النشطة من الأعشاب الخام. ديكوتيون المياه هو إجراء استخراج الكلاسيكية التي لا تزال تستخدم على نطاق واسع في الإعدادات السريرية. هنا، نقترح بروتوكول مفصل ل إر-زيان مغلي (إكسد) من أجل تطبيق ديكوكتيونس العشبية للدراسات التجريبية. يتم وصف حساب الجرعة المناسبة للحيوان، وكذلك الخطوات الرئيسية الأربعة من إكسد: تمرغ، مغلي الماء، والترشيح، والتركيز. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض إكسد المصل المحتوية على المصل إلى الفئران كوسيلة للتحقق من صحة المختبر . هنا، كانت الفئران تدار شفويا إكسد لمدة ثلاثة أيام. ثم تم جمع عينات الدم، المعطل، الطرد المركزي، وتصفيتها. المصل، المخفف مع الوسط الثقافي، يمكن أن تستخدم لعلاج الخلايا أو الأنسجة في الخامسإترو. على سبيل المثال، تم تطبيق إكسد على حد سواء في الجسم الحي وفي الدراسات المختبرية وأظهرت أن إكسد يعزز تكوين العظم. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم كمرجع لإعداد وتطبيق الأدوية العشبية.

Introduction

الاهتمام في دراسة وتطبيق الأدوية العشبية التقليدية ينمو حاليا. على عكس الأدوية الحديثة، التي المكونات الكيميائية هي محددة، الصيغ العشبية لديها بعض المكونات غير معروفة وتتطلب عمليات استخراج لتمكين تسليم المركبات النشطة. على الرغم من أن العديد من الدراسات في محاولة لتحديد مجمع صغير واحد مع بنية معروفة كممثل من عشب كامل أو صيغة العشبية، لا يمكن اعتبار أي فعالية الدوائية أو آليات يعادل 1 ، 2 . في حين أن البصمات تمكن من تحليل مكونات الصيغ العشبية المعقدة، وبعض المكونات لا تزال غير تحليلها بشكل واضح، مما يؤدي إلى تحدي عند الجمع بين جميع مقتطفات للدراسة 3 . التفاعلات من العديد من المكونات / مقتطفات توسط الآثار العلاجية للأدوية العشبية. للحفاظ على هذه الميزة، استخراج التقليدية شكل ديكوكت أيون-لا يزال يستخدم على نطاق واسع في العيادة. منذ إجراء استخراج له تأثير كبير على فعالية العلاجية، وبروتوكول قياسي من مغلي المياه التقليدية ضروري، وخاصة بالنسبة للدراسات في الجسم الحي 4 ، 5 .

من ناحية أخرى، عند استكشاف الآليات الدوائية، وإدارة الاستغناء العشبية أثناء الدراسات في المختبر أو خارج الجسم الحي هو أيضا تحديا. وقد اقترح تاشينو في عام 1988 مفهوم المصل الذي يحتوي على المخدرات 6 . ومنذ ذلك الحين، طبقت أعداد متزايدة من الباحثين على الأدوية العشبية 7 و 8 و 9 . على الرغم من أن طريقة المصل يحتوي على المخدرات لديها بعض القيود، مثل تأثير بعض مكونات المصل، فإنه لا يزال يعتبر أن الطريقة التي تحاكي عن كثب الظروف الفسيولوجية.

"jove_content"> تم تطوير مغلي إير-زيان في أوائل 1950s لتخفيف أعراض انقطاع الطمث 10 ، 11 ، 12 ، 13 . كما تم تطبيقه على علاج فقر الدم اللاتنسجي 14 ، هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث 15 ، 16 ، 17 ، سابق لأوانه فشل المبيض 18 ، سرطان الثدي 19 ، سرطان المبيض 20 ، وتأخر سن البلوغ 21 . هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد كل من مغلي إشيان (إكسد) والمصل الذي يحتوي على المخدرات. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تطبيق إكسد و إكسد التي تحتوي على المصل إلى نماذج هشاشة العظام الفئران الفئران.

ويتكون إكسد من 9 غرام كل من كوركوليغو أورشيوادس غايرتن ، هيربا إبيمديي الرقم الأساسي مورينداي المخزنية ، والجذر انجليكا سينينسيس و 6 غرام كل من اللحاء فيلودندري و ريزوما أنيمارهيني لكل مريض بالغ يوميا. الجرعة المكافئة للفأرة هي 0.1418 إكسد / كغ / يوم استنادا إلى المعادلة التالية 22 : دب = دا * رب / را * (وا / وب) 1/3 . دا و دب يشير إلى الجرعة لكل وزن الجسم (ملغ / كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي. يتم استبدال الجرعة، في ملغ / كغ، بعدد إكسد / كغ. ويمثل را و رب عامل الجسم البشري وعامل جسم الفأر، على التوالي، والتي تتناسب مع (مساحة سطح الجسم (م 2 ) / وزن الجسم (كغ)) 2/3 (انظر الجدول 1 ). وا و وب تشير إلى وزن الجسم (كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي، وهي معتمدة من قبل التجربة الحيوانية لجنة الأخلاقيات الحيوانية شنغهاي.

1 - البروتوكول الأول: إعداد إكسد

  1. عملية حسابية
    1. إدارة إكسد لمجموعة العلاج من 10 الفئران إمبرينتينغ السيطرة المنطقة (إكر) الفئران (0.02 كجم / ماوس)، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 1.702 إكسد. لأن إكسدس تقاس بزيادات منفصلة، ​​في الممارسة الحقيقية، إدارة 2 إكسدس.
    2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الماوس ( أي V = (0.1418 إكسد / كغ • يوم) * (0.02 كجم / الماوس) * 50 مل / إكسد = 0.14 مل / ماوس • اليوم).
  2. تمرغ
    1. وضع جميع المواد الخام من اثنين إكسدز ( أي، كوركوليغو أورشيوادس غايرتن (18 غرام)، هيربا إبيمديي (18 غرام)، الرقم الأساسي موريندي أوفيسيناليس (18 غرام)، Rأديكس أنجليسا سينينسيس (18 غراما)، اللحاء فيلودندري (12 غراما)، و ريزوما أنيمارهيني (12 غراما)، 96 غرام في المجموع) في وعاء مع غطاء.
      ملاحظة: يوصى بحاوية خزفية.
    2. مكررات الأعشاب الخام مع 500 مل من الماء المقطر لمدة 1 ساعة. يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
  3. أول مغلي الماء
    1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ الغاز أو طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على قوة التدفئة، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). رفض السلطة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
  4. الترشيح الأول
    1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
    2. إعادة بقايا الأعشاب المتبقية سn ورق الترشيح إلى الحاوية.
  5. مغلي الماء الثاني
    1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
    2. كرر الخطوة 1.3.
  6. الترشيح الثاني
    1. كرر الخطوات 1.4.1 و 1.4.2.
    2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق. خلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
  7. تركيز
    1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الاسبستوس خالية من الشاش الأسلاك بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وببطء وبشكل مستمر اثارة مع قضيب من الزجاج.
    2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 200 مل، نقله إلى كوب 500 مل.
    3. كرر الخطوة 1.7.1 حتى ديكوتيون يقلل إلى 100 مل.
  8. التخزين والإدارة
    1. نقل ديكوتيون المركزة إلى زجاجة معقمة. السماح لها باردة إلى غرفة تمبراتوري (رت). تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    2. باستخدام إبرة التزقيم، وإدارة 0.14 مل / الماوس من ديكوتيون ل أوفاريكتوميزد (أوفكس) الفئران مرة واحدة يوميا، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.

2. البروتوكول الثاني: إعداد المصل المحتوي على إكسد

  1. عملية حسابية
    1. حساب الجرعة المكافئة للفئران (ريد) باستخدام 0.15 كغ وزن الجسم لكل فئران (1 شهر من العمر): ديسيبل = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 إكسد / كغ / يوم.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 10 مل من المصل المحتوي على إكسد لإعداد 100 مل من الوسط الثقافي (10٪ من المصل يحتوي على إكسد). ومن المتوقع أن توفر 2 مل من الفئران كل الفئران. وبالتالي، هناك حاجة إلى 6 الفئران (خسارة 20٪ في الاعتبار) لإدارة إكسد مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. عدد إكسدس هو: (0.111 إكسد / كغ • يوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (6 الفئران) * (3 أيام) = 0.300 إكسد. مرة أخرى، لأن إكسدس يتم قياسها في زيادات منفصلة،استخدام 1 إكسد.
    2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الفئران ( أي، V = (0.111 إكسد / كجم في اليوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (50 مل / إكسد) = 0.83 مل / الفئران • اليوم).
  2. تمرغ
    1. وضع المواد الخام ل 1 إكسد في وعاء مع غطاء. مكررات الأعشاب الخام في الماء المقطر لمدة 1 ساعة؛ يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
  3. أول مغلي الماء
    1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على الطاقة الحرارية، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). تحويل الطاقة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
  4. الترشيح الأول
    1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
  5. مغلي الماء الثاني
    1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
    2. كرر الخطوة 2.4.
  6. الترشيح الثاني
    1. كرر الخطوات 2.5.1 و 2.5.2.
    2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق كما في الخطوة 2.4.1 وتخلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
  7. تركيز
    1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الشاش الأسلاك خالية من الاسبستوس بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وإثارة ببطء وبشكل مستمر مع قضيب من الزجاج.
    2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 100 مل، نقله إلى كوب 100 مل.
    3. كرر الخطوة 2.7.1 حتى يقلل ديكوتيون إلى 50 مل.
  8. التخزين والإدارة
    1. نقل ديكوتيون المركزة إلى سترإيل، قنينة الزجاج. السماح لتبرد ل رت. تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    2. إدارة عن طريق الفم 0.83 مل / الفئران مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام.
  9. إكسد التي تحتوي على إعداد المصل
    1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 300 مل / 100 غرام من 80 ملغ / كغ من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين في 1 ساعة بعد آخر إدارة إكسد. تأكيد التخدير الصحيح عن طريق قرصة أخمص قدميه.
    2. شق الجلد والبريتوني من الفئران من البطن إلى الجزء السفلي من الصدر باستخدام مشرط (أو مقص التشغيل على التوالي). إنشاء شق طول وعمق حوالي 5 سم و 0.5 سم، على التوالي. نقل أحشاء البطن إلى اليسار باستخدام ورقة الأنسجة.
    3. باستخدام ورقة الأنسجة، وإزالة النسيج الضام من الشريان الأورطي البطني للكشف بوضوح السفينة.
    4. رسم الدم ببطء من الشريان الأورطي البطني باستخدام 10 مل، 22-حقنة قياس. نقله إلىأنبوب معقم 15 مل بعد إزالة الإبرة. فئران واحدة يمكن أن تنتج 8-10 مل من الدم.
      ملاحظة: يجب أن يكون الفئران على قيد الحياة ( أي، مع البطن الشريان الأورطي النابض) عند بدء رسم الدم والموتى بعد اكتمال الرسم.
    5. تخثر الدم في وضع مستقيم لمدة 30 - 60 دقيقة في الغرفة رت. أجهزة الطرد المركزي في 500-600 x ج لمدة 20 دقيقة. وضع بعناية كل طاف (المصل) في أنبوب 50 مل واحد معقمة وتخلط كل المصل (من الحيوانات المختلفة) معا.
    6. أداء تعطيل الحرارة عن طريق احتضان المصل في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تصفية المصل باستخدام مرشح حقنة مع 0.22 ميكرون حجم المسام غشاء بوليثرزولفون ماء. استخدام المصل جديدة أو تخزينه في -20 درجة مئوية.
  10. السيطرة على المخدرات التي تحتوي على إعداد المصل (المستخدمة في مجموعة السيطرة)
    1. إدارة كل الفئران مع نفس الحجم من المياه المالحة (0.83 مل) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. الخطوات الأخرى هي نفسها كما في الخطوة 2.9.
  11. الوضعية
    1. إضافة 10 مل من المصل تحتوي على إكسد المصل أو المخدرات التي تحتوي على كل 100 مل من المتوسطة، بالإضافة إلى 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) 23 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تأثير إكسد على كثافة العظام من الفئران أوفكس

يظهر هيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ القسم الفقرات القطنية زيادة ترابيك العظام بعد العلاج إكسد في الجسم الحي ( الشكل 1A ، اللوحة اليمنى) مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة أوفكس ( الشكل 1A ، اللوحة اليسرى). ويبين الشكل 1B الصور μCT ممثل القطني 4TH في الفئران أوفكس ( الشكل 1B ، اللوحة اليسرى) والفئران أوفس مع العلاج إكسد لمدة 12 أسبوعا ( الشكل 1B ، اللوحة اليمنى). وينظر أكثر العظام التربيقية داخل فقرة قطنية من الفئران المعالجة إكسد من تلك التي تسيطر عليها الفئران أوفكس. وتشير البيانات من التصوير μCT إلى زيادة حجم العظام / الأنسجة حجم (بف / تف)، عدد ترابيقي (تب N)، وسمك التربيقية (تب. ث) وانخفاض تباعد التربيقية (تب. سب) من القطني الرابع في الفئران إكسد ( الشكل 1C ).

تأثير إكسد على تكوين العظم من الخلايا الجذعية الوسيطة العظم (بمسك) من الفئران أوفكس

الشكل 2 يمثل إمكانات عظمية من بمسك. يتم تشكيل قطرات الدهون (النجمة، شكل غير منتظم من قطرة الدهون) تلقائيا عندما مثقبة بمسك من الفئران أوفس مثقف لمدة 7 أيام ( الشكل 2A ، اللوحة اليسرى). في الفئران المعالجة إكسد، تتشكل العقيدات العظام (السهم) بدلا من قطرة الدهون ( الشكل 2B ، اللوحة اليمنى). فحص الفوسفاتيز القلوية (ألب) يدل على أن المزيد من الخلايا إيجابية إيجابية (الأرجواني) يمكن الكشف عنها في بمسكس المعالجة إكسد ( الشكل 2B ، اللوحة اليمنى) مقارنة مع تلك في بمسك من الفئران أوفكس السيطرة ( الشكل 2B ، اللوحة اليسرى).

التغييرات في التعبير الجيني بين الفئران أوفكس و إكسدالصورة = "XREF"> 24

وتظهر التكتلات الهرمية أن التعبير عن 389 جينة كشفت عن طريق ميكروأري في بمسك تم تغيير أضعاف (> 1.5، تطبيع من قبل الفئران غير أوفكس) بين أوفكس و إكسد المعالجة الفئران في الجسم الحي (المجموع: 26،991 الجينات) ( الشكل 3 ). يشير اللون الأخضر إلى أن التعبير قد تم تنظيمه، في حين يشير اللون الأحمر إلى أن التعبير كان دونريغولاتد. يتم تجميع ثلاث عينات في نفس المجموعة معا أولا، مما يدل على صفات موثوقة من التشكيل الجانبي. ويبين الشكل 4 مسار الإشارات المتداخلة المستهدفة من قبل إكسد، سواء في الجسم الحي وفي المختبر .

شكل 1
الشكل 1: تأثير إكسد على مورفولوجيا العظام.
( A ) H & E تلطيخ الجزء القطني 4 ث من أوفكس و إكسد المعالجة الفئران. ( C ) الكمي ل μCT. بف: حجم العظام، التلفزيون: حجم الأنسجة، Tb.N: عدد ترابيقي، تب. ث: سمك التربيقي، و Tb.Sp: تباعد تربيقي. تمثل الأعمدة الوسائل ± سي. ن = 6 لكل مجموعة. * p <0.05، ** p <0.01 إكسد مقابل أوفكس (t تيست). ( أس ) تم تعديلها من شوفن ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تأثير إكسد على بمسك التمايز.
( A ) صور من بمسك مثقف لمدة 7 أيام بعد بينغ، عزل عزل، من، ال التعريف، عظم الفخذ، بسبب، أوفس، أو، إكسد-فوسد، مايس. * يشير إلى قطرة الدهون. يشير السهم إلى عقيدة عظم. ( B ) تلطيخ ألب أوفكس و بمسكس المعالجة إكسد مثقف لمدة 7 أيام (الأرجواني يمثل ألب إيجابية). ( C ) الكمي من ( B ). الأعمدة تمثل وسائل ± سي من ثلاثة أطباق (ستة الفئران) لكل مجموعة. ** p <0.01 إكسد مقابل أوفكس (t تيست للطالب). ( أس ) تم تعديلها من شوفن ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: تأثير إكسد على ملف تعريف التعبير الجيني.
خريطة حرارية للتجمعات الهرمية للتعبير عن 389 الجينات في أوفس و بمسكس إكسد حصادها في اليوم السابع بعد التفكك. المقياس (صورة صغيرة) يشير إلى تغييرات أضعاف تطبيعها بمسكس غير أوفكس. وترد قائمة الجينات في الملف التكميلي 1 . تم تعديل هذا الرقم من شوفين ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: تأثير إكسد على مسار الإشارات المتراكبة في كل من فيفو وفي المختبر التجارب.
أول 10 متداخلة مسارات الإشارات التي يتم عكسها من قبل إكسد في الجسم الحي والمصل التي تحتوي على إكسد في المختبر على أساس مسار كيغ. وتظهر الجينات المتعلقة بالمسارات في الملف التكميلي 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

محيط الفأر فأر خنزير غينيا أرنب قط قرد الكلب بشري
R 59 90 99 93 82 111 104 100

الجدول 1: عامل R في أنواع مختلفة.
عامل R في 8 الأنواع التي تستخدم عادة في البحوث الدوائية. عامل R يتناسب مع: (مساحة سطح الجسم (م 2 ) / بأودي الوزن (كغالعلامة)) 2/3 .

الملف التكميلي 1.
معلومات عن 389 الجينات التي يتم تنظيمها أو دونريغولاتد ≥ 1.5 أضعاف ولكن يتم إنقاذها من قبل إكسد في الجسم الحي . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2.
معلومات عن مسار الإشارات (على أساس مسار كيغ) والجينات ذات الصلة في كل من فيفو والتجارب في المختبر . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في السنوات الأخيرة، تم إيلاء المزيد من الاهتمام للأدوية العشبية، وهو نوع واحد من الطب البديل الذي تم تطبيقه في الإعداد السريري في العالم الشرقي لآلاف السنين. مختلفة من "مقعد إلى السرير" نمط الطب الحديث، والأدوية العشبية التقليدية تتطلب أولا "السرير إلى مقاعد البدلاء" نمط لشرح آلياتها. ويمكن أن يتبع ذلك التحقق من صحة أجريت في مرحلة مقاعد البدلاء ومعالجة لتطوير الأدوية المحسنة حديثا. حتى الآن، هناك العديد من أساليب الاستخراج التي تم الإبلاغ عنها إلى المكونات النشطة الإفراج عن الصيغ كاملة أو الأعشاب. من بينها، واستخراج المياه هو الأكثر استخداما على نطاق واسع.

استخراج المياه من الأدوية العشبية لديها أربع خطوات أساسية. الخطوة الأولى هي تمرغ. يتم تعقيد الأدوية العشبية المعقدة في الماء لفترة من الزمن، وعادة من 0.5 إلى 1 ساعة. الفترة الزمنية للتمدد يعتمد على كمية وممتلكات الأعشاب الخام. إلىتأكد من أن الأعشاب الخام غارقة تماما، وسط كل قطعة أو كتلة يجب أن تكون غارقة. حجم المياه يعتمد على الحجم الكلي للأعشاب. في بعض الأحيان، يتم استخدام وزن الأعشاب لتحديد كمية المياه اللازمة للتمرغ. ومع ذلك، وكثافة عشب تختلف على نطاق واسع. وبما أن الغرض من النقع هو تقشير جميع الأعشاب، وتسهيل الإفراج عن المكونات النشطة خلال الخطوات التالية، ويفضل حجم الأعشاب للاستخدام كمعيار مرجعي لحجم المياه. الخطوة الثانية هي الطهي. وقد تم تطوير عمليات الغليان والسطوح على مدى آلاف السنين. التباين في وقت الطهي يعتمد في الغالب على نوع من الأعشاب، وذلك بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية والطبية المختلفة 12 . يقترح ديافوريتيكش لطهي الطعام لفترة قصيرة من الزمن، وعادة أقل من 20 دقيقة، في حين يجب أن تضاف العطريات قبل بضع دقائق فقط من الغليان الأولى لتجنب ردود الفعل المتقلبة. Fأو منشط الأعشاب، فترة طويلة من الوقت مطلوب لترشيح مكوناتها العلاجية. في هذه الحالة، يتم استخدام إكسد لعلاج هشاشة العظام بعد سن اليأس على مدى عقود 12 . في نظرية الطب الصيني التقليدي، تعتبر هذه المتلازمة ناجمة عن نقص في الكلى. إكسد يهدف أساسا إلى تونيفي الكلى. ولذلك، تم طهي إكسد لمدة 2 - 3 ساعة للسماح لل إكسد لممارسة آثاره المضادة لل هشاشة العظام 15 . الخطوة الثالثة هي الترشيح. الترشيح يساعد على منع إبرة التزقيم من انسداد مع حبيبات العشبية. الخطوة الرابعة هي التركيز. وينبغي النظر بعناية في حجم إدارة التزقيم. وقد أفيد أن كميات كبيرة، مثل 10 مل / كغ أو أكثر، تدار عن طريق التزقيم عن طريق الفم يمكن أن يؤدي إلى العديد من المشاكل المتعلقة امتصاص، بما في ذلك التحول السريع للمركبات إلى الاثنى عشر أو الالتهاب الرئوي الطموح المرتبطة ارتداد السلبي من خواص الموادلتر في المريء 25 . وهكذا، كانت أحجام اختيار الفئران والجرذان حوالي 7.5 مل / كغ و 5.5 مل / كغ، على التوالي.

من المهم تأكيد ما إذا كانت المكونات الفعالة لهضمها واستقلاب إكسد في الدم هي مماثلة لتلك المستخلص الخام. من حيث التكافؤ البيولوجي إكسد، وو وآخرون. ذكرت تحديد 7 مكونات في البلازما الكلب: إبيمدين A، إبيمدين B، إبيمدين C، إكارين، ساجيتاتوسيد B، 2 "-O- رامنوسيل إيكاريسيد الثاني، وبوهوسيد I 26 . هو وآخرون. وجدت 21 مركبات في البلازما الفئران بعد تناوله عن طريق الفم 27 . وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن استخراج الخام من إكسد. ومع ذلك، فإن بعض المكونات الفعالة التي تم اختبارها في الدم، مثل إكارين و بربارين، تم تطبيقها مباشرة على الحيوانات من أجل المقارنة المقارنة 28 .

هناك نهج متعددة لحساب بيو الحيوانكوفالنت جرعة. الطريقة التقليدية على أساس وزن الجسم (ملغ / كغ) ليست مناسبة لأن الدوائية تختلف في أنواع مختلفة. الحساب على أساس مساحة سطح الجسم (ملغ / م 2 )، الذي يرتبط معدل الأيض إلى حجم الحيوان الفردية، وكثيرا ما تستخدم 29 . المعادلة المطبقة هنا تأخذ مساحة سطح الجسم ووزن الجسم في الاعتبار، وتستخدم عادة في الطب الصيني التقليدي 30 .

ويمكن اختيار أنواع كثيرة من الحيوانات، مثل الأرانب والخنازير الغينية والجرذان والفئران، لإعداد المصل المحتوي على المخدرات. ويفضل نفس النوع كما في الخلايا المختبرة في المختبر . في هذه الدراسة، تم اختيار الفئران لأنها توفر المزيد من المصل من الفئران تفعل وأقرب إلى الفئران من حيث الأنواع مقارنة مع الحيوانات الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يوصى مكافئ الجرعة في استخدام الجسم الحي أو عيادة، كما أظهر بروتوكول في المختبر . المخففأيون المصل (1:10 يوصى) لا تؤخذ بعين الاعتبار. وهذا هو، لا يتم تطبيق 10 أضعاف من الجرعة المكافئة للحيوانات المصل المقدمة بسبب رد فعل سامة المحتملة الناجمة عن الخلايا المعالجة أو الأعضاء 31 . تردد إدارة المخدرات يختلف من مرة واحدة في اليوم لمدة 3-14 أيام إلى مرتين في اليوم (2 ساعة بين كل إدارة) 7 ، 8 ، 32 . وقت جمع عادة ما يحدث بين ساعة 1 و 2 (قبل ساعة 6) بعد آخر إدارة 33 ، 34 . والهدف من ذلك هو الحفاظ على تركيز الدواء في الدم مستقرة نسبيا وعند مستوى الذروة عند جمع العينات 35 . ويمكن أن تشمل إجراءات الإدارة الحقن، وإدارة الجلد، أو الاستنشاق، وفقا لروتين إدارة الجسم الحي .

إن تعطيل المخدرات -التي تحتوي على مصل لا تزال مثيرة للجدل. يعتقد أنصار أن وجود العديد من المكونات النشطة، مثل الهرمونات والانزيمات والأجسام المضادة، ومكملات في المصل نفسه، قد يؤدي إلى ردود فعل غير متوقعة تؤثر على النتائج 36 . وتعتقد المعارضة أن المكونات النشطة التي تنتجها المخدرات يمكن أيضا إزالتها من خلال عملية التعطيل 37 . لتحقيق التوازن في هذا، والناس تصميم مجموعة السيطرة بحيث يتم استخدام المصل من الحيوانات المعالجة المالحة.

هناك بعض القيود على البروتوكول. لا يتم تقييم جودة استخراج قبل البدء في الجسم الحي والتجارب في المختبر . ثانيا، يتم استخدام المضادات الحيوية في الوسط الثقافي، مما قد يسبب تفاعلات عشبية المخدرات ويتطلب المزيد من الاختبارات. ثالثا، يتم تحديد تمرغ ويترك على نار خفيفة الوقت استنادا إلى الخبرة المكتسبة من الممارسة السريرية والتجارب الحيوانية. يمكن اختيار المزيد من الفترات الزمنية fأو المقارنة. يمكن نقع مرات تمرغ ويترك على نار خفيفة لمختلف الصيغ العشبية. يمكن تعديل حجم مغلي لإدارة الحيوانات وفقا للأنواع والسن والوزن من الحيوان. يمكن تغيير الحيوان الذي تم اختياره لإعداد المصل المحتوية على المخدرات ولإجراءات الإدارة، كما نوقش أعلاه.

مجتمعة، والبروتوكول والنتائج توفر مثالا لإعداد وتطبيق مغلي العشبية في الجسم الحي ودراسات المختبر . في حالات مختلفة، بعض التفاصيل يجب أن يكون الأمثل، بما في ذلك فترات العلاج، والأنواع، وإجراءات الإدارة، على أساس الخصائص العشبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81573992). نشكر إميلي K. لو وكاثلين دينابولي لمساعدتهم تحرير اللغة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) 160922 EXD components
Filter paper GElifesciences 99-103-952 Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 In vivo study
Sprague Dawley rats Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 EXD-containing serum preparation
Syringe filter Millipore SLGP033RB 0.22 µm
gavage needles (10 ml) Shanghai BO Ge trade sales department 59104274 Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)  Fujian Gutian Pharma Co. Ltd H35020148 Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg) Sunway Pharma Co. Ltd CB07591 Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium Gibco 12800-116 DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin Sigma 1277 100 µg / ml
Penicillin Sigma 4687 100 µg / ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
  2. Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
  3. Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
  4. Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
  5. Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
  6. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
  7. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
  8. Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
  9. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
  10. Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
  11. Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
  12. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  13. Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
  14. Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
  15. Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
  16. Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
  17. Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
  18. Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
  19. Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
  20. Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
  21. Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
  22. Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
  23. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  24. Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
  25. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  26. Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
  27. Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
  28. Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
  29. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  30. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  31. Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
  32. Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
  33. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  34. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  35. Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  36. Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  37. Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).

Tags

الطب، العدد 123، إيه زيان مغلي، المصل التي تحتوي على المخدرات، الصيدلة في الدم، والأدوية العشبية، الطب التكاملي، الطب الصيني التقليدي،
إعداد الأدوية العشبية: إير-زيان ديكوتيون و إير-زيان التي تحتوي على مصل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; التجارب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J.,… More

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55654, doi:10.3791/55654 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter