Summary
ここでは、浸漬、煎出、ろ過、および濃縮の4段階でerxian decoction（EXD）の準備を行い、準備したEXD含有血清のラットへの投与を実証する。これらの方法は、伝統的な漢方薬などの薬草煎じ薬のin vivoおよびin vitro研究に適用可能である。
Abstract
近年、臨床現場での代替薬である伝統的な漢方薬が注目されています。身体に送達する前に、生薬から活性成分を放出するためには、一般的に追加の抽出手順が必要である。水煎出は、臨床の場で広く使用されている古典的な抽出手順です。ここでは、薬草煎じ薬を実験研究に適用するために、エキソ煎じ薬（EXD）の詳細なプロトコルを提案する。 EXDの主要な4つのステップ（浸漬、水煎出、濾過、濃縮）と同様に、動物に適した投与量の計算が記載されています。さらに、血清含有EXDをインビトロでの検証の手段としてラットに導入する。ここでは、ラットにEXDを3日間経口投与した。次いで、血液サンプルを収集し、不活性化し、遠心分離し、濾過した。培養培地で希釈した血清を用いて、細胞または組織をvitro。例えば、EXDはインビボおよびインビトロ研究の両方に適用され、EXDが骨形成を増強することが実証された。このプロトコールは、漢方薬の調製および応用の参考として用いることができる。
Introduction
伝統的な漢方薬の研究と応用に関心が高まっています。化学成分が明確な現代薬とは対照的に、ハーブ処方には未知の成分があり、活性成分の送達を可能にするために抽出プロセスが必要です。多くの研究は、ハーブまたはハーブの処方全体の代表として、よく知られている構造を持つ1つの小さな化合物を選択しようとしていますが、薬理学的有効性やメカニズムは同等ではありません1,2 。フィンガープリンティングは複雑な漢方式の構成成分の分析を可能にするが、一部の成分は依然として明確に分析されていないため、研究3のすべての抽出物を組み合わせる際に問題が生じる。多数の成分/抽出物の相互作用は、漢方薬の治療効果を媒介する。この利点を保持するために、伝統的な抽出物の形態イオンは、依然として診療所で広く使用されています。抽出手順は治療効果に大きな影響を与えるため、特にインビボ研究では、伝統的な水煎出の標準プロトコールが必要である4,5。
他方、薬理学的機構を調べる場合、 インビトロまたはエクスビボの研究中の薬草煎じ薬の投与も課題である。薬物含有血清の概念は、1988年にTashinoによって最初に提案された6 。それ以来、数多くの研究者が漢方薬に適用しています7,8,9。薬物含有血清の方法は、血清の特定の成分の影響などのいくつかの制限があるが、依然として生理学的条件を厳密に模倣する方法であると考えられている。
14 、閉経骨粗鬆症15,16,17、早期卵巣不全18 、乳癌19 、卵巣癌20 、思春期遅発21の治療にも適用されています。ここでは、エラシアン煎剤（EXD）とその薬物含有血清の両方の調製のための詳細なプロトコールを提示する。加えて、我々は、ネズミ更年期骨粗鬆症モデルに対するEXDおよびEXD含有血清の適用を記載する。
EXDは、 9gのCurculigo orchioides Gaertn 、 Herba Epimedii Radix Morindae Officinalis 、 Radix Angelicae Sinensis 、 Cortex PhellodendriおよびRhizoma Anemarrhenaeそれぞれ6gを 1日当たりに投与する。マウスの等価線量は、以下の式22に基づいて0.1418EXD / kg /日である。dB = dA * RB / RA *（WA / WB） 1/3 。 dAおよびdBは、それぞれ、ヒトおよびマウスの体重当たりの用量（mg / kg）を示す。用量は、mg / kgで、EXD / kgの数で置き換えられる。 RAおよびRBは、（体表面積（m 2 ）/体重（kg）） 2/3 （ 表1参照）に比例するヒト身体因子およびマウス体係数をそれぞれ表す。 WAおよびWBは、それぞれヒトおよびマウスの体重（kg）を示す。
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Protocol
このプロトコルは上海漢方医学の動物飼育指針に従っており、動物実験上海動物倫理委員会の承認を受けています。
1.プロトコルI：EXDの調製
- 計算
- 6ヵ月齢の女性刷本管理領域（ICR）マウス（0.02kg /マウス）10匹の治療群にEXDを投与し、1週間あたり5日間12週間投与する。
注：合計1.702 EXDが必要です。 EXDは離散的な増分で測定されるため、実際には2つのEXDを管理します。 - マウス1匹につき適用されるEXDの量を計算する（ すなわち、 V =（0.1418 EXD / kg・日）*（0.02kg /マウス）* 50mL / EXD = 0.14mL /マウス・日）。
- 6ヵ月齢の女性刷本管理領域（ICR）マウス（0.02kg /マウス）10匹の治療群にEXDを投与し、1週間あたり5日間12週間投与する。
- 浸漬
- 2つのEXDのすべての原材料（ すなわち、Curculigo orchioides Gaertn （18g）、 Herba Epimedii （18g）、 Radix Morindae Officinalis （18g）、 R（18g）、 Cortex Phellodendri （12g）、 Rhizoma Anemarrhenae （12g）、合計96g）を蓋付き容器に入れた。
注：セラミック容器を推奨します。 - 生ハーブを500mLの蒸留水で1時間洗浄します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。
- 2つのEXDのすべての原材料（ すなわち、Curculigo orchioides Gaertn （18g）、 Herba Epimedii （18g）、 Radix Morindae Officinalis （18g）、 R（18g）、 Cortex Phellodendri （12g）、 Rhizoma Anemarrhenae （12g）、合計96g）を蓋付き容器に入れた。
- 最初の水の煎じ薬
- 水が沸騰するまで（約5〜10分;加熱時間、容器、およびハーブと水の量に依存します）、ガス炊飯器または誘導加熱調理器を使用してハーブを高熱で加熱します。低煮沸の電源を2時間倒します。
- 最初のろ過
- 定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。
- 残った薬草残渣を返す容器にろ紙を移す。
- 2回目の水煎じ
- ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。
- 手順1.3を繰り返します。
- 二次ろ過
- ステップ1.4.1と1.4.2を繰り返します。
- 2回目の煎じ薬を同じビーカーに注ぎます。 1回目と2回目の煎じ薬を混ぜる。
- 濃度
- ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んでガス炊飯器の上に置き、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。
- 煎剤が200 mLになったら、500 mLのビーカーに移す。
- 煎じ薬が100mLになるまでステップ1.7.1を繰り返します。
- 保管と管理
- 濃縮した煎じ薬を滅菌ガラス瓶に移す。それは室温に冷やしてみましょう再（RT）。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。
- 強制栄養針を用いて、1日1回、1週間に5日、12週間、卵巣摘出（OVX）マウスに煎じ薬0.14mL /マウスを投与する。
2.プロトコルII：EXD含有血清の調製
- 計算
- 各ラット（1ヶ月齢）の体重として0.15kgを用いて、ラット相当用量（RED）を計算する：dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） 1/3 = 0.111 EXD / kg /日。
注：100mLの培地（10％EXD含有血清）を調製するためには、合計10mLのEXD含有血清が必要です。各ラットは2mLの血清を提供すると予想される。したがって、EXD投与には1日1回3日間、6匹のラット（20％の損失を考慮する）が必要である。 EXDの数は、（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（6匹のラット）*（3日）= 0.300 EXD。再び、EXDは離散的な増分で測定されるので、1 EXDを使用します。 - ラット（ すなわち、 V =（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（50mL / EXD）= 0.83mL /ラット・日）に適用されるEXDの容量を計算する。
- 各ラット（1ヶ月齢）の体重として0.15kgを用いて、ラット相当用量（RED）を計算する：dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） 1/3 = 0.111 EXD / kg /日。
- 浸漬
- 1 EXD用の原料を蓋付き容器に入れます。生ハーブを蒸留水に1時間浸します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。
- 最初の水の煎じ薬
- 水が沸騰するまで（約5〜10分;時間は熱出力、容器、およびハーブと水の量に依存します）、誘導加熱器を高出力で使用してハーブを加熱します。電源を2時間低煮沸にします。
- 最初のろ過
- 定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。
- 2回目の水煎じ
- ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。
- ステップ2.4を繰り返します。
- 二次ろ過
- 手順2.5.1と2.5.2を繰り返します。
- ステップ2.4.1と同じビーカーに2回目の煎じ薬を注ぎ、1回目と2回目の煎じ薬を混ぜます。
- 濃度
- ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んだガス炊飯器に入れ、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。
- 煎じ薬が100mLになったら、100mLビーカーに移す。
- 煎じ薬が50mLになるまで2.7.1の手順を繰り返します。
- 保管と管理
- 濃縮煎じ薬をステーに移すガラス瓶。それをRTに冷やす。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。
- 1日1回、0.83mL /ラットを3日間胃内投与する。
- EXD含有血清調製物
- 最後のEXD投与の1時間後に300mg / 100gの80mg / kgケタミンおよび10mg / kgキシラジンを腹腔内注射することによりラットを麻酔する。つま先で適切な麻酔を確認してください。
- メスを使用して腹部から胸郭の底にラットの皮膚と腹膜を切開する（またはまっすぐに操作するはさみ）。それぞれ約5cmと0.5cmの長さと深さの切開を作成します。ティッシュペーパーを使用して腹部内臓を左に動かします。
- ティシュペーパーを使用して、腹部大動脈の結合組織を除去して、血管をはっきりと露出させる。
- 10mL、22ゲージのシリンジを使用して、腹部大動脈からゆっくりと血液を採取する。それを転送する針を除去した後の15mLの滅菌チューブ; 1匹のラットは8〜10mLの血液を産生することができる。
注：採血が始まるとラットは生きている（ すなわち、腹部大動脈が拍動する）。 - 室温RTで30〜60分間、直立姿勢で血液を凝固させる。 500-600×gで20分間遠心分離する。すべての上清（血清）を注意深く1つの50mLの滅菌チューブに入れ、すべての血清（異なる動物由来）を一緒に混合する。
- 血清を56℃の水浴中で30分間インキュベートすることにより熱不活性化を行う。 0.22μmの孔径の親水性ポリエーテルスルホン膜を有するシリンジフィルターを用いて血清を濾過する。新鮮な血清を使用するか、-20℃で保存してください。
- 対照薬物含有血清調製物（対照群において使用される）
- 1日1回3日間同じ容量の生理食塩水（0.83mL）で各ラットを投与する。他のステップはステップ2.9と同じです。
- 応用
- EXD含有血清または薬物含有血清10mLを各100mLの培地に加え、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PS） 23に加える。
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Representative Results
OVXマウスの骨密度に対するEXDの効果
腰椎切片のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、OVX群（ 図1A 、左パネル）と比較して、 インビボでの EXD処置後の骨梁の増加を示す（ 図1A 、右パネル）。 図1Bは、OVXマウス（ 図1B 、左パネル）および12週間のEXD処置を行ったOVXマウス（ 図1B 、右パネル）における4 番目の腰部の代表的なμCT画像を示す。 EXD処理マウスの腰椎内には、対照OVXマウスよりも多くの骨梁が見られる。 μCT画像からのデータは、第4腰椎の骨量/組織体積（BV / TV）の増加、小柱数（Tb.N）、および小柱の厚さ（Tb。Th）および小柱間隔（Tb。Sp） EXDマウス（ 図1C ）において観察した。
OVXマウス由来の骨間葉系幹細胞（bMSC）の骨形成に対するEXDの効果
図2は、 bMSCの骨形成能を示す。 OVXマウスのbMSCを7日間培養すると、脂肪滴（アスタリスク、脂質液滴の不規則な形状）が自動的に形成される（ 図2A 、左パネル）。 EXDで処置したマウスでは、脂肪小滴の代わりに骨結節（矢印）が形成される（ 図2B 、右パネル）。アルカリホスファターゼ（ALP）アッセイは、対照OVXマウス由来のbMSC（ 図2B 、左パネル）と比較して、より多くのALP陽性細胞（紫）がEXD処理bMSC（ 図2B 、右パネル）で検出できることを実証する。
OVXマウスとEXDマウスとの間の遺伝子発現の変化s = "xref"> 24
階層的クラスタリングは、bMSCにおけるマイクロアレイによって明らかにされた389個の遺伝子の発現が、インビボで OVXおよびEXD処置マウス（合計26,991個の遺伝子）の間で変化した（非OVXマウスによって正常化された> 1.5）（ 図3 ）ことを示す。緑色は発現がアップレギュレートされたことを示し、赤色は発現がダウンレギュレーションされたことを示す。同じグループの3つのサンプルが最初にクラスタリングされ、プロファイルの信頼できる品質が示されます。 図4は、 インビボおよびインビトロの両方において、 EXDが標的とする重複シグナル伝達経路を示す 。
図1：骨形態に及ぼすEXDの影響
（ A ）OVXおよびEXD処置マウスの腰部4セクションのH＆E染色。 （
図2：EXDがbMSCの分化に及ぼす影響
（ A ）bei後7日間培養したbMSCの画像OVXまたはEXD処置マウスの大腿骨から単離した。 *は脂肪滴を示す。矢印は骨の結節を示す。 （ B ）7日間培養したOVXおよびEXD処理したbMSCのALP染色（紫はALP陽性を示す）。 （ C ）（ B ）の定量。列は、群当たり3皿（6匹のマウス）の平均±SEを表す。 ** OVX対p <0.01 EXD（スチューデントのt検定）。 （ AC ）は、Shufen Liu ら 24. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：EXDの遺伝子発現プロファイルへの影響。
OVXおよびEXD bMSCにおける389遺伝子発現の階層的クラスタリングのヒートマップ解散後7 日目に収穫される。スケール（小さな画像）は、OVX以外のbMSCによって正規化された倍率変化を示す。遺伝子のリストはSupplemental File 1で提供されています。この図は、Shufen Liu ら 24. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4： in vivoおよびin vitro実験の両方における重複シグナル伝達経路に対するEXDの効果。
最初の10個の重複したシグナル伝達経路は、in vivoでEXDによって逆転され、EXD含有血清はin vitroで KEGG経路に基づいて逆転される。経路に関連する遺伝子は、 Supplemental File 2に示されている。/files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 種 | マウス | ラット | モルモット | ウサギ | ネコ | モンキー | 犬 | 人間 |
| R | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
表1：異なる種におけるR因子。
薬理研究で一般的に使用されている8種のR因子。 R係数は、（体表面積（m 2 ）/ b肥料（kg）） 2/3 。
補足ファイル1。
インビボで EXDによりレスキューされるが、1.5倍以上にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされている389遺伝子に関する情報。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足ファイル2。
インビボおよびインビトロの両方の実験におけるシグナル経路（KEGG経路に基づく）および関連遺伝子に関する情報。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
近年、東アジアの臨床現場で何千年も使用されてきた代替薬の一種であるハーブ薬が注目されています。伝統的な漢方薬は、現代医学の「ベンチ・ベッド」のパターンとは異なり、まずそのメカニズムを説明するために「ベッド・ツー・ベンチ」のパターンが必要です。これに続いて、ベンチ段階で行われた検証と、新たに最適化された薬物の開発のための処理が続く。これまで、数式またはハーブ全体から有効成分を放出するいくつかの抽出方法が報告されています。その中でも、水抽出が最も広く用いられている。
漢方薬の水抽出には4つの基本的なステップがあります。最初のステップは浸ることです。複雑な漢方薬は、水中で一定時間、通常0.5〜1時間浸軟されます。浸漬時間は生ハーブの量と性質に依存します。に生ハーブが徹底的に浸されていることを確認し、すべてのピースまたはブロックの中心部を浸してください。水の量は、ハーブの総量に依存します。時折、ハーブの重量は、浸すために必要な水の量を決定するために使用されます。しかし、ハーブの密度は大きく異なります。浸漬の目的は、すべてのハーブを細かくすることであり、以下のステップで活性成分の放出を促進するため、ハーブの量は、水量の参照標準として使用することが好ましい。 2番目のステップは料理です。沸騰プロセスと沸騰プロセスは数千年にわたって開発されてきました。調理時間の変化は、その物理的、化学的、薬理学的特性が異なるため、主にハーブの種類に依存します12 。嚥下障害は、揮発性反応を避けるために、最初の沸騰の数分前に芳香族化合物を加えるべきである一方、短時間、通常は20分未満で調理することが示唆されている。 Fまたは強壮剤のハーブでは、治療成分を浸出するのに長い時間が必要です。この場合、EXDは数十年にわたる閉経後の骨粗鬆症の治療に使用されています12 。伝統的な中国医学の理論では、この症候群は腎臓関連の欠陥によって引き起こされると考えられています。 EXDは、主に腎臓をトーン化するように設計されています。したがって、EXDは2〜3時間調理され、EXDがその抗骨粗鬆症効果を発揮することができた15 。第3の工程は濾過である。ろ過は、胃管針がハーブ顆粒で詰まるのを防ぐのに役立つ。第4段階は濃縮である。胃管投与量は慎重に検討する必要があります。経口胃管栄養法によって投与される10mL / kg以上のような大量投与では、化合物の十二指腸への急速なシャント、または受動肺炎の受動的逆流を含む吸収に関するいくつかの問題が生じることが報告されている物質食道25に入る。したがって、マウスおよびラットについて選択した容量は、それぞれ約7.5mL / kgおよび5.5mL / kgであった。
血液中の消化され代謝されたEXDの有効成分が生抽出物のものと同様であるかどうかを確認することが重要である。 EXD生物学的同等性に関して、Wu らエピメディンA、エピメディンB、エピメディンC、イカリイン、サジタトシドB、2 "-O-ラムノシルカリセリドII、およびバオウサイドI 26の7つの成分の決定を報告している 。 Hu ら経口投与後のラット血漿中21種の化合物を見出した27 。今のところ、EXDからの生の抽出物は報告されていない。しかし、icariinやberberineのような血液中で試験された有効成分のいくつかは、比較観察のために動物に直接適用されている28 。
動物の生物を計算するための複数のアプローチがあります二価の線量。薬物動態は異なる種によって異なるので、体重に基づく伝統的な方法（mg / kg）は適切ではない。代謝率が個々の動物の大きさに関係する体表面積（mg / m 2 ）に基づく計算は、しばしば用いられる29 。ここで適用される方程式は体表面積と体重の両方を考慮に入れ、一般的に伝統的な中国薬30で利用されます。
ウサギ、モルモット、ラット、およびマウスのような多くの種類の動物を薬物含有血清調製のために選択することができる。 インビトロで処理した細胞と同じ種が好ましい。この研究では、ラットは、マウスよりも血清を多く与え、他の動物と比較して種に関してマウスに近いため、選択された。さらに、 in vitroプロトコールに示されているように 、 インビボまたはクリニックの使用量で同等の用量が推奨される 。ジラット血清のイオン（1:10を推奨）は考慮されていません。すなわち、処置された細胞または器官31によって引き起こされる潜在的な毒性反応のために、同等の用量の10倍が血清提供動物に適用されない31 。薬物投与頻度は、1日1回3〜14日間、1日2回（各投与の2時間）7,8,32で変化する。収集時間は、通常、最後の投与33,34後1時間〜2時間（6時間前）に発生します。その目的は、血液中の薬物濃度を比較的安定して維持することであり、試料が採集されるときにそのピークレベルで維持されることである35 。投与ルーチンは、 インビボ投与ルーチンに従って、注射、皮膚投与、または吸入を含むことができる。
薬物依存性細胞の不活性化は、依然として議論の余地がある。サポーターは、ホルモン、酵素、抗体、補体などの多くの活性成分が血清自体に存在すると、予期せぬ反応を引き起こし、結果に影響を与える可能性があると考えています36 。野党は、薬物によって生成された活性成分も、不活性化プロセス37によって除去されると考えている。これをバランスさせるために、人々は生理食塩水で処置した動物からの血清が使用されるように対照群を設計する。
プロトコルにはいくつかの制限があります。抽出物の品質は、 インビボおよびインビトロ実験を開始する前に評価されない。第2に、抗生物質が培地中で使用され、これは薬草相互作用を引き起こし、さらなる試験を必要とする。第3に、浸漬時間および煮詰め時間は、臨床実習および動物実験から得られた経験に基づいて決定される。より多くの時間を選択することができますfまたは比較。浸漬時間と煮詰め時間は、異なる漢方式に合わせて変更することができます。動物投与のための煎出量は、動物の種および年齢および体重に応じて変更することができる。上記のように、薬物含有血清の調製および投与ルーチンのために選択された動物は、変更することができる。
総合すると、プロトコールおよび結果は、 インビボおよびインビトロ研究におけるハーブ煎じ薬の調製および適用の例を提供する。異なる場合には、薬草の特性に基づいて、治療期間、種、および管理ルーチンを含む詳細のいくつかを最適化しなければならない。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団（81573992）によって支持された。私たちはEmily K. LoとKathleen DiNapoliの言語編集支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
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