Summary
Her presenterer vi utarbeidelsen av en er-xian-avkok (EXD) i fire trinn-soaking, avkok, filtrering og konsentrasjon - og demonstrerer administrering av et forberedt EXD-holdig serum til rotter. Disse metodene gjelder for in vivo og in vitro- studien av urtedekk, slik som tradisjonelle kinesiske medisiner.
Abstract
Tradisjonell urtemedisin, en alternativ medisin i klinisk setting, har fått økt oppmerksomhet de siste årene. Før levering til kroppen, er det nødvendig med en ekstra utvinningsfremgangsmåte for å frigjøre de aktive bestanddelene fra rå urter. Vannavkok er en klassisk ekstraksjonsprosedyre som fortsatt er stort brukt i de kliniske innstillingene. Her foreslår vi en detaljert protokoll for er-xian decoction (EXD) for å påføre urtedekk i eksperimentelle studier. Beregningen av en dyrtilpasset dose er beskrevet, så vel som de fire hovedtrinnene i EXD: soaking, vannavkok, filtrering og konsentrasjon. I tillegg introduseres serumholdig EXD til rotter som et middel for in vitro validering. Her ble rotter administrert oralt EXD i tre dager. Blodprøver ble deretter samlet, inaktivert, sentrifugert og filtrert. Serumet, fortynnet med dyrkningsmediet, kan benyttes til å behandle celler eller vev i vItro. Eksempelvis ble EXD påført både in vivo og in vitro studier og viste at EXD øker osteogenesen. Denne protokollen kan brukes som referanse for forberedelse og bruk av urtemedisiner.
Introduction
Interessen for studiet og anvendelsen av tradisjonell urtemedisin vokser for tiden. I motsetning til moderne stoffer, der kjemiske ingredienser er klare, har urteformler noen ukjente ingredienser og krever ekstraksjonsprosesser for å muliggjøre levering av deres aktive forbindelser. Selv om mange studier forsøker å velge en liten forbindelse med en kjent struktur som representant for hele urt- eller urteformelen, kan verken farmakologiske virkninger eller mekanismer betraktes som ekvivalente 1 , 2 . Mens fingeravtrykk gjør det mulig å analysere bestanddelene av komplekse urteformler, er enkelte bestanddeler fortsatt ikke klart analysert, noe som fører til en utfordring når man kombinerer alle ekstraktene til studie 3 . Samspillet mellom mange bestanddeler / ekstrakter medierer terapeutiske effekter av urte medisiner. For å beholde denne fordelen, den tradisjonelle ekstrakt form-decoctIon-brukes fortsatt mye i klinikken. Siden ekstraktprosedyren har stor innvirkning på den terapeutiske effekten, er det nødvendig med en standardprotokoll for tradisjonell vannavkok, spesielt for in vivo- studier 4 , 5 .
På den annen side, når man utforsker farmakologiske mekanismer, er administrasjon av urtedekk i løpet av in vitro eller ex vivo- studier også en utfordring. Konseptet med et medikamentholdig serum ble først foreslått av Tashino i 1988 6 . Siden da har økende antall forskere brukt det på urtemedisin 7 , 8 , 9 . Selv om metoden for medikamentholdig serum har noen begrensninger, som for eksempel påvirkning av visse komponenter i serumet, anses det fortsatt for å være en metode som nøyaktig etterligner fysiologiske forhold.
10 , 11 , 12 , 13 . Det har også blitt brukt på behandling av aplastisk anemi 14 , menopausal osteoporose 15 , 16 , 17 , tidlig eggstokkesvikt 18 , brystkreft 19 , eggstokkreft 20 og forsinket pubertet 21 . Her presenterer vi detaljerte protokoller for utarbeidelse av både er-xian-avkoket (EXD) og dets medikamentholdige serum. I tillegg beskriver vi anvendelsen av EXD og EXD-holdig serum til muse-menopausal osteoporotiske modeller.
En EXD består av 9 g hver av Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis og Radix Angelicae Sinensis og 6 g hver av Cortex Phellodendri og Rhizoma Anemarrhenae per voksen pasient per dag. Tilsvarende dose for en mus er 0,1418 EXD / kg / dag basert på følgende ligning 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA og dB refererer til dosen per kroppsvekt (mg / kg) av henholdsvis henholdsvis menneske og mus. Dosen, i mg / kg, erstattes med antall EXD / kg. RA og RB representerer henholdsvis kroppsfaktor og muskroppfaktor, som er proporsjonal med kroppsoverflaten (m 2 ) / kroppsvekt (kg)) 2/3 (se tabell 1 ). WA og WB indikerer kroppsvekten (kg) av henholdsvis menneske og mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjer for dyrepleie av Shanghai University of Traditional Chinese Medicine og er godkjent av dyreforsøkene Shanghai Animal Ethics Committee.
1. Protokoll I: Fremstilling av EXD
- beregning
- Administrer EXD til en behandlingsgruppe på 10 seks måneder gamle kvinnelige Impressive Control Region (ICR) mus (0,02 kg / mus), 5 dager i uken i 12 uker.
MERK: Det er nødvendig med totalt 1 702 EXD-er. Fordi EKDer måles i diskrete trinn, administrerer i ekte praksis 2 EXDer. - Beregn volumet av EXD påført per mus ( dvs. V = (0,1418 EXD / kg • dag) * (0,02 kg / mus) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / mus • dag).
- Administrer EXD til en behandlingsgruppe på 10 seks måneder gamle kvinnelige Impressive Control Region (ICR) mus (0,02 kg / mus), 5 dager i uken i 12 uker.
- soaking
- Legg alle råmaterialene i to eksoser ( dvs. Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) og Rhizoma Anemarrhenae (12 g), totalt 96 g) i en beholder med lokket.
MERK: En keramisk beholder anbefales. - Makere de rå urter med 500 ml destillert vann i 1 time; Vannet skal dekke urter med omtrent en tomme. La alle urter grundig suge.
- Legg alle råmaterialene i to eksoser ( dvs. Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) og Rhizoma Anemarrhenae (12 g), totalt 96 g) i en beholder med lokket.
- Første vannavkok
- Varm urter med en gasskoker eller en induksjonskokeren med høy effekt til vannet kjeller (ca. 5 - 10 min, tidsperioden avhenger av varmen, beholderen og mengden urter og vann). Slå av strømmen til en lavkoker i 2 timer.
- Første filtrering
- Dekk et glassbeholder på 500 ml med vanlig filterpapir eller med gasbind og bomull. Helt forsiktig av avkokingen inn i bægeret gjennom filteret. La urter i beholderen.
- Return gjenværende urte rester oN filterpapiret til beholderen.
- Andre vannavkok
- Tilsett destillert vann i beholderen med urter; La det dekke urter med omtrent en tomme.
- Gjenta trinn 1.3.
- Andre filtrering
- Gjenta trinn 1.4.1 og 1.4.2.
- Hell den andre avkokingen i samme beger. Bland de første og andre dekkene sammen.
- Konsentrasjon
- Sett bøkene på en gasskomfyr med asbestfri trådgass mellom dem, varme avkokingen ved hjelp av lavt simmer og sakte og kontinuerlig rør med en glassstang.
- Når avkoket reduseres til 200 ml, overfør det til et 500 ml beger.
- Gjenta trinn 1.7.1 til avkoket reduseres til 100 ml.
- Lagring og administrasjon
- Overfør den konsentrerte avkok til en steril glassflaske. La det avkjøles til romtemperaturenRe (RT). Oppbevares ved 4 ° C ved bruk innen en uke eller ved -70 ° C for langtidsoppbevaring.
- Bruk en forseglingsnål, administrer 0,14 ml / mus av avkoket til ovariektomiserte (OVX) mus en gang per dag, 5 dager i uken i 12 uker.
2. Protokol II: Fremstilling av EXD-holdig serum
- beregning
- Beregn rotte-ekvivalent dose (RED) ved å bruke 0,15 kg som kroppsvekten til hver rotte (1 måned gammel): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
MERK: Totalt 10 ml EXD-holdig serum er nødvendig for å fremstille 100 ml dyrkningsmedium (10% EXD-holdig serum). Hver rotte forventes å gi 2 ml serum. Dermed er 6 rotter (et 20% tap tatt i betraktning) nødvendig for EXD-administrasjon en gang daglig i 3 dager. Antall EKD er: (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rotte) * (6 rotter) * (3 dager) = 0.300 EXD. Igjen, fordi EKD er målt i diskrete trinn,Bruk 1 EXD. - Beregn volumet av EXD påført per rotte ( dvs. V = (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rotte) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / rotte • dag).
- Beregn rotte-ekvivalent dose (RED) ved å bruke 0,15 kg som kroppsvekten til hver rotte (1 måned gammel): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
- soaking
- Legg råvarene til 1 EXD i en beholder med lokket. Makere de rå urter i destillert vann i 1 time; Vannet skal dekke urter med omtrent en tomme. La alle urter grundig suge.
- Første vannavkok
- Varm urter med en induksjonskokeren på høy effekt til vannet koker (ca. 5 - 10 min, tidsperioden avhenger av varmen, beholderen og mengden urter og vann). Slå av strømmen til en lavkoker i 2 timer.
- Første filtrering
- Dekk et glassbeholder på 500 ml med vanlig filterpapir eller med gasbind og bomull. Helt forsiktig av avkokingen inn i bægeret gjennom filteret. La urter i beholderen.
- Andre vannavkok
- Tilsett destillert vann i beholderen med urter; La det dekke urter med omtrent en tomme.
- Gjenta trinn 2.4.
- Andre filtrering
- Gjenta trinn 2.5.1 og 2.5.2.
- Hell den andre avkokingen i samme beger som i trinn 2.4.1 og bland den første og den andre dekoksen sammen.
- Konsentrasjon
- Sett bøkeren på en gasskomfyr med asbestfri trådgass mellom dem, varme avkokingen ved hjelp av en lavt simmer og sakte og kontinuerlig rør med en glassstang.
- Når avkoket reduseres til 100 ml, overfør det til et 100 ml beger.
- Gjenta trinn 2.7.1 til avkoket reduserer til 50 ml.
- Lagring og administrasjon
- Overfør den konsentrerte avkok til en stjerneIle glassflaske. La det avkjøles til RT. Oppbevares ved 4 ° C ved bruk innen en uke eller ved -70 ° C for langtidsoppbevaring.
- Administrer intragastrisk 0,83 ml / rotte en gang daglig i 3 dager.
- EXD-holdig serumpreparat
- Bedøv rottene ved intraperitonealt injeksjon av 300 ml / 100 g 80 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin ved 1 time etter siste administrering av EXD. Bekreft riktig bedøvelse ved tåp.
- Opplev huden og peritoneum fra rotta fra magen til bunnen av thoraxen ved hjelp av en skalpell (eller rett operasjonssaks). Lag et snitt av lengde og dybde på henholdsvis 5 cm og 0,5 cm. Flytt magesekken til venstre ved hjelp av vevpapir.
- Ved hjelp av vevpapir, fjern bindevevet i abdominal aorta for å tydelig utsette fartøyet.
- Tegn blodet sakte fra abdominal aorta ved hjelp av en 10 ml, 22 gauge sprøyte. Overfør den tilEt 15 ml sterilt rør etter fjerning av nålen; En rotte kan produsere 8-10 ml blod.
MERK: Roten skal være i live ( dvs. med abdominal aorta pulserende) når blodtegningen begynner og død etter at tegningen er fullført. - Klut blodet i oppreist stilling i 30 - 60 minutter ved romtemperatur. Sentrifuge ved 500-600 xg i 20 minutter. Plasser forsiktig hele supernatanten (serum) i ett 50 ml sterilt rør og bland hele serumet (fra forskjellige dyr) sammen.
- Utfør varmeinaktivering ved å inkuberer serumet i et 56 ° C vannbad i 30 minutter. Filtrer serumet ved hjelp av et sprøytefilter med en 0,22 μm porestørrelses hydrofil polyetersulfonemembran. Bruk serum frisk eller oppbevar det ved -20 ° C.
- Kontroller legemiddelholdig serumpreparat (brukt i kontrollgruppen)
- Administrer hver rotte med samme volum saltoppløsning (0,83 ml) en gang per dag i 3 dager. De andre trinnene er de samme som i trinn 2.9.
- Søknad
- Tilsett 10 ml EXD-holdig serum eller medikamentholdig serum til hver 100 ml medium, pluss 1% penicillin-streptomycin (PS) 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av EXD på bentettheten av OVX-mus
Hematoksylin og eosin (H & E) -farging av lumbale vertebra-seksjonen viser økt ben-trabekulae etter EKD-behandling in vivo ( Figur 1A , høyre panel) sammenlignet med de i OVX-gruppen ( Figur 1A , venstre panel). Figur 1B viser de representative μCT-bildene av den fjerde lumbale i OVX-mus ( Figur 1B , venstre panel) og OVX-mus med EXD-behandling i 12 uker ( Figur 1B , høyre panel). Flere trabekulære bein settes inn i lumbale vertebra av EXD-behandlede mus enn de av OVX-kontrollmus. Dataene fra μCT-imaging indikerer et økt beinvolum / vevvolum (BV / TV), trabekulært nummer (Tb. N) og trabekulær tykkelse (Tb. Th) og redusert trabekulær avstand (Tb Sp) av den fjerde lumbale I EXD-mus ( figur 1C ).
Effekten av EXD på osteogenesen av ben mesenkymale stamceller (bMSCs) fra OVX-mus
Figur 2 representerer det osteogene potensialet av bMSCs. Fettdråper (asterisk, uregelmessig form av en lipiddråpe) dannes automatisk når bMSCs av OVX-mus dyrkes i 7 dager ( Figur 2A , venstre panel). I EXD-behandlede mus dannes knutnutler (pil) i stedet for en fettdråpe ( figur 2B , høyre panel). En alkalisk fosfataseanalyse (ALP) demonstrerer at flere ALP-positive celler (lilla) kan detekteres i EXD-behandlede bMSC'er ( Figur 2B , høyre panel) sammenlignet med de i bMSCer fra kontroll-OVX-mus ( Figur 2B , venstre panel).
Endringene i genuttrykk mellom OVX og EXD-muss = "ekstern referanse"> 24
Hierarkisk clustering viser at uttrykket av 389 gener avslørt av mikroarray i bMSCs ble brettet endret (> 1,5, normalisert av ikke-OVX-mus) mellom OVX og EXD-behandlede mus in vivo (totalt: 26 991 gener) ( Figur 3 ). Grønt indikerer at uttrykket var upregulated, mens rødt indikerer at uttrykket var nedregulert. Tre prøver i samme gruppe er samlet sammen først, noe som indikerer de pålitelige egenskapene til profilen. Figur 4 viser den overlappede signalveien som er målrettet av EXD, både in vivo og in vitro .
Figur 1: Effekten av EXD på benmorfologi.
( A ) H & E-farging av lumbale 4. del av OVX- og EXD-behandlede mus. (
Figur 2: Effekten av EXD på bMSC Differensiering.
( A ) Bilder av bMSCs dyrket i 7 dager etter beiNg isolert fra femur av OVX eller EXD-behandlede mus. * Indikerer en fettdråpe. En pil indikerer et knuteknute. ( B ) ALP-farging av OVX- og EXD-behandlede bMSC'er dyrket i 7 dager (lilla representerer ALP-positiv). ( C ) Kvantifisering av ( B ). Kolonnene representerer middelene ± SE fra tre retter (seks mus) per gruppe. ** p <0,01 EXD versus OVX (Studentens t-test). ( AC ) er blitt modifisert fra Shufen Liu et al. 24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekten av EXD på genuttrykksprofilen.
Heatmap av den hierarkiske clustering av uttrykk for 389 gener i OVX og EXD bMSCs Høstet på den 7. dagen etter disassociation. Skalaen (lite bilde) indikerer falsendringer normalisert av ikke-OVX bMSCs. Listen over gener er gitt i tilleggsfil 1 . Figuren er blitt modifisert fra Shufen Liu et al. 24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekten av EXD på overlappede signalveier i både in vivo og in vitro eksperimenter.
De første 10 overlappede signalveiene som reverseres av EXD in vivo og EXD-holdig serum in vitro basert på KEGG-banen. Generene relatert til banene er vist i tilleggsfil 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Arter | Mus | Rotte | marsvin | Kanin | Katt | Ape | Hund | Menneskelig |
| R | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
Tabell 1: R-faktor i forskjellige arter.
R-faktoren i 8 arter som vanligvis brukes i farmakologisk forskning. R-faktoren er proporsjonal med: (kroppsoverflateareal (m 2 ) / bOdy vekt (kg)) 2/3 .
Supplerende fil 1.
Informasjon om 389 gener som er oppregulert eller nedregulert ≥1,5 ganger, men er reddet av EXD in vivo . Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil 2.
Informasjon om signalveien (basert på KEGG-banen) og beslægtede gener i både in vivo og in vitro eksperimenter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de siste årene har mer oppmerksomhet blitt gitt til urte medisiner, en type alternativ medisin som har blitt brukt i kliniske omgivelser i den østlige verden i tusenvis av år. Forskjellig fra "benk til sengs" mønster av moderne medisin, krever tradisjonell urtemedisin først "seng til benk" mønster for å forklare mekanismene sine. Dette kan følges av validering utført på benk-scenen og behandling for utvikling av nylig optimaliserte legemidler. Så langt er det flere ekstraksjonsmetoder som har blitt rapportert til frigjørende aktive komponenter fra hele formler eller urter. Blant dem er vannutvinning den mest brukte.
Vannutvinningen av urtemedisiner har fire grunnleggende trinn. Det første trinnet er bløting. En kompleks urtemedisin er makerert i vann i en tidsperiode, vanligvis fra 0,5 til 1 time. Tidsperioden for soaking er avhengig av mengden og egenskapen til de rå urter. TilSørg for at de rå urter er grundig gjennomvåt, midten av hvert stykke eller blokk skal være gjennomsyret. Vannvolumet avhenger av det totale volumet av urter. Noen ganger er vekten av urter brukt til å bestemme hvor mye vann er nødvendig for bløting. Men urtete densiteter varierer mye. Siden hensikten med soaking er å macerate alle urter, for å lette frigjøring av de aktive komponentene under de følgende trinnene, er volumet av urter foretrukket for bruk som referansestandard for volumet av vann. Det andre trinnet er matlaging. Koknings- og simmeringsprosessene er utviklet i tusenvis av år. Variasjonen i tilberedningstiden avhenger mest av typen urter på grunn av deres forskjellige fysiske, kjemiske og farmakologiske egenskaper 12 . Diaphoretikk anbefales å lage mat i en kort periode, vanligvis mindre enn 20 minutter, mens aromater bør tilsettes bare noen få minutter før den første kokingen for å unngå flyktige reaksjoner. FEller tonic urter, er en lang periode nødvendig for å utlekke ut deres terapeutiske bestanddeler. I dette tilfellet brukes EXD til behandling av postmenopausal osteoporose over årtier 12 . I tradisjonell kinesisk medisinsteori anses dette syndromet for å være forårsaket av en nyre-relatert mangel. EXD er hovedsakelig designet for å tonifisere nyrene. Derfor ble EXD kokt i 2 - 3 timer for å tillate EXD å utøve sine anti-osteoporotiske effekter 15 . Det tredje trinnet er filtrering. Filtrering bidrar til å forhindre at nålen blir tilstoppet med urtegranulatene. Det fjerde trinnet er konsentrasjon. Volumet av gavageadministrasjon bør vurderes nøye. Det har blitt rapportert at store mengder, slik som 10 ml / kg eller mer, administrert ved oral sondring, kan resultere i flere problemer knyttet til absorpsjon, inkludert hurtig avspilling av forbindelsene til duodenum eller aspirasjon lungebetennelse forbundet med passiv tilbakeløp av materiaJeg går inn i spiserøret 25 . Dermed var volumene valgt for mus og rotter henholdsvis 7,5 ml / kg og 5,5 ml / kg.
Det er viktig å bekrefte om de effektive komponentene av fordøyd og metabolisert EXD i blodet ligner de av rå ekstrakt. I form av EXD bioekvivalens, Wu et al. Rapporterte bestemmelsen av 7 komponenter i hund plasma: epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin, sagittatosid B, 2 "-O-rhamnosyl icariside II og baohuosid I 26 . Hu et al. Funnet 21 forbindelser i rotteplasma etter oral administrering 27 . Hittil har ikke råproduktet fra EXD blitt rapportert. Noen av de effektive komponentene som er testet i blod, som icariin og berberin, har imidlertid blitt brukt direkte på dyr for sammenlignende observasjon 28 .
Det er flere tilnærminger for å beregne dyret bioeKvivalent dose. Den tradisjonelle metoden basert på kroppsvekt (mg / kg) er ikke hensiktsmessig fordi farmakokinetikken varierer i forskjellige arter. Beregningen basert på kroppsoverflate (mg / m 2 ), hvor metabolismen er relatert til den enkelte dyrestørrelse, brukes ofte 29 . Tilsvarende ligning tar hensyn til kroppsoverflate og kroppsvekt, og brukes ofte i tradisjonell kinesisk medisin 30 .
Mange typer dyr, som kaniner, marsvin, rotter og mus, kan velges for medikamentholdig serumpreparasjon. Samme art som for de in vitro- behandlede celler er foretrukket. I denne studien ble rotter valgt fordi de gir mer serum enn mus gjør og er nærmere mus i form av arter sammenlignet med andre dyr. I tillegg anbefales dosekvivalenten i in vivo eller klinikkbruk, som in vitro- protokollen viste. FortynnetIon av serum (1:10 anbefales) er ikke tatt i betraktning; Det vil si at 10 ganger av ekvivalent dose ikke påføres de serumleverte dyrene på grunn av den potensielle giftige reaksjon forårsaket av behandlede celler eller organer 31 . Legemiddeladministrasjonsfrekvensen varierer fra en gang daglig til 3 til 14 dager til to ganger per dag (2 timer mellom hver administrering) 7 , 8 , 32 . Samlingstiden oppstår vanligvis mellom time 1 og 2 (før time 6) etter siste administrasjon 33 , 34 . Målet er å holde stoffkonsentrasjonen i blodet relativt stabil og på toppnivå når prøvene samles 35 . Administrasjonsrutiner kan inkludere injeksjon, hudadministrasjon eller inhalering, i samsvar med in vivo administreringsrutiner.
Inaktivering av medikament-Inneholdende serum er fortsatt kontroversielt. Tilhengere tror at tilstedeværelsen av mange aktive komponenter, for eksempel hormoner, enzymer, antistoffer og komplementer i selve serumet, kan føre til uventede reaksjoner som påvirker resultatene 36 . Opposisjonen mener at de aktive komponentene som produseres av legemidlene, også kan fjernes ved inaktiveringsprosessen 37 . For å balansere dette, utformer folk kontrollgruppen slik at serum fra saltvannbehandlede dyr blir brukt.
Det er noen begrensninger for protokollen. Kvaliteten på ekstraktet blir ikke evaluert før man starter in vivo og in vitro- eksperimenter. For det andre brukes antibiotika i kulturmediet, noe som kan forårsake urte-stoffinteraksjoner og krever ytterligere testing. For det tredje bestemmes soaking og simmer-tiden basert på opplevelsen hentet fra klinisk praksis og dyreforsøk. Flere tidsperioder kan velges fEller sammenligning. Soaking og simmer ganger kan modifiseres for forskjellige urteformler. Avkokvolumet for dyredyring kan modifiseres i henhold til arten og dyrets alder og vekt. Dyret som er valgt for fremstilling av medikamentholdig serum og for administreringsrutiner kan endres, som omtalt ovenfor.
Tillsammans gir protokollen og resultatene et eksempel på forberedelse og anvendelse av urtedekok i in vivo og in vitro studier. I forskjellige tilfeller må noen av detaljene optimaliseres, inkludert behandlingsperioder, arter og administrasjonsrutiner, basert på urteegenskapene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81573992). Vi takker Emily K. Lo og Kathleen DiNapoli for deres språkredigeringshjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
- Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
- Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
- Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
- Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
- Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
- Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
- Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
- Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
- Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
- Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
- Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
- Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
- Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
- Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
- Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
- Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
- Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
- Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
- Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
