Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Подготовка травяной медицины: Er-Xian Decoction и Er-Xian-содержащая сыворотка для Published: May 31, 2017 doi: 10.3791/55654
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2The Academy of Integrative Medicine of Fudan University

Summary

Здесь мы представляем подготовку эрсианского отвара (EXD) в четыре этапа - вымачивание, отвар, фильтрацию и концентрацию - и демонстрируем введение готовой EXD-содержащей сыворотки крысам. Эти методы применимы к исследованиям in vivo и in vitro травяных отваров, таких как традиционные китайские лекарства.

Abstract

Традиционная фитотерапия, альтернативная медицина в клинических условиях, получила повышенное внимание в последние годы. Перед доставкой в ​​организм обычно требуется дополнительная процедура экстракции для выделения активных компонентов из сырых трав. Отвар воды - классическая процедура экстракции, которая до сих пор широко используется в клинических условиях. Здесь мы предлагаем подробный протокол для отсасывания er-xian (EXD), чтобы применить травяные отвары к экспериментальным исследованиям. Описывается расчет подходящей для животных дозы, а также четыре основных этапа EXD: вымачивание, отвар воды, фильтрация и концентрация. Кроме того, сыворотку, содержащую EXD, вводят крысам в качестве средства проверки in vitro . Здесь крысам перорально вводили EXD в течение трех дней. Затем образцы крови собирали, инактивировали, центрифугировали и фильтровали. Сыворотка, разбавленная культуральной средой, может быть использована для лечения клеток или тканей в vИтро. Например, EXD применяли как к in vivo, так и in vitro исследованиям и продемонстрировали, что EXD усиливает остеогенез. Этот протокол может использоваться в качестве справочника для подготовки и применения лекарственных трав.

Introduction

В настоящее время растет интерес к изучению и применению традиционной фитотерапии. В отличие от современных лекарств, в которых химические ингредиенты являются определенными, растительные формулы имеют некоторые неизвестные ингредиенты и требуют экстракционных процессов, чтобы обеспечить доставку их активных соединений. Хотя многие исследования пытаются выбрать одно небольшое соединение с хорошо известной структурой как представитель всей травы или растительной формулы, ни фармакологическая эффективность, ни механизмы не могут считаться эквивалентными 1 , 2 . В то время как отпечатки пальцев позволяют анализировать составляющие сложных лекарственных препаратов, некоторые составляющие до сих пор неясно анализируются, что приводит к сложной проблеме при объединении всех экстрактов для исследования 3 . Взаимодействие многочисленных компонентов / экстрактов опосредует терапевтические эффекты лекарственных трав. Чтобы сохранить это преимущество, традиционная форма экструзии-decoctИон - все еще широко используется в клинике. Поскольку процедура экстракции оказывает большое влияние на терапевтическую эффективность, необходим стандартный протокол традиционного отвара воды, особенно для исследований in vivo 4 , 5 .

С другой стороны, при исследовании фармакологических механизмов введение травяных отваров во время исследований in vitro или ex vivo также является проблемой. Концепция лекарственно-содержащей сыворотки была впервые предложена Ташино в 1988 году 6 . С тех пор все большее число исследователей применили его к фитотерапии 7 , 8 , 9 . Хотя метод лекарственно-содержащей сыворотки имеет некоторые ограничения, такие как влияние некоторых компонентов сыворотки, он по-прежнему считается методом, который точно имитирует физиологические условия.

10 , 11 , 12 , 13 . Он также применяется для лечения апластической анемии 14 , менопаузального остеопороза 15 , 16 , 17 , преждевременной овариальной недостаточности 18 , рака молочной железы 19 , рака яичников 20 и задержки полового созревания 21 . Здесь мы приводим подробные протоколы для подготовки как er-xian decoction (EXD), так и его содержащей лекарственные средства сыворотки. Кроме того, мы описываем применение сыворотки, содержащей EXD и EXD, к моделям остеопороза мышиных менопаузы.

EXD состоит из 9 г каждого из Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis и Radix Angelicae Sinensis и 6 г каждого из Cortex Phellodendri и Rhizoma Anemarrhenae на взрослого пациента в день. Эквивалентная доза для мыши составляет 0,1418 EXD / кг / день на основе следующего уравнения 22 : дБ = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . ДА и дБ относятся к дозе на вес тела (мг / кг) человека и мыши, соответственно. Доза в мг / кг заменяется на количество EXD / кг. RA и RB представляют собой фактор человеческого тела и фактор тела мыши, соответственно, которые пропорциональны (площадь поверхности тела (м 2 ) / масса тела (кг)) 2/3 (см. Таблицу 1 ). WA и WB указывают вес тела (кг) человека и мыши соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол соответствует руководящим принципам ухода за животными в Шанхайском университете традиционной китайской медицины и одобрен экспериментальным комитетом по этике животных в Шанхае.

1. Протокол I: Подготовка EXD

  1. расчет
    1. Администрируйте EXD в группу лечения из 10 шестимесячных мышей Imprinting Control Region (ICR) (0,02 кг / мышь), 5 дней в неделю в течение 12 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В общей сложности требуется 1,702 EXD. Поскольку EXD измеряются дискретными приращениями, в реальной практике администрируйте 2 EXD.
    2. Рассчитайте объем EXD, нанесенный на мышь ( т.е. V = (0,1418 EXD / кг • день) * (0,02 кг / мышь) * 50 мл / EXD = 0,14 мл / мышь • день).
  2. намокание
    1. Поместите все исходные материалы двух EXD ( т. Е. Curculigo orchioides Gaertn (18 г), Herbaa Epimedii (18 г), Radix Morindae Officinalis (18 г), RAdix Angelicae Sinensis (18 г), Cortex Phellodendri (12 г) и Rhizoma Anemarrhenae (12 г), всего 96 г) в контейнер с крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется использовать керамический контейнер.
    2. Мацевать сырые травы с 500 мл дистиллированной воды в течение 1 часа; Вода должна покрывать травы примерно на дюйм. Пусть все травы полностью впитаются.
  3. Первый отвар воды
    1. Нагрейте травы с помощью газовой плиты или индукционной плиты на высокой мощности до тех пор, пока вода не закипит (около 5 - 10 минут, временной интервал зависит от мощности нагрева, емкости, количества трав и воды). В течение 2 часов отключите питание до низкой температуры.
  4. Первая фильтрация
    1. Накройте стеклянный стакан емкостью 500 мл с обычной фильтровальной бумагой или с марлей и хлопка. Осторожно вылейте отвар в стакан через фильтр. Оставьте травы в контейнере.
    2. Возвратите оставшийся травяной остаток oN фильтровальную бумагу в контейнер.
  5. Второй отвар воды
    1. Добавить дистиллированную воду в контейнер с травами; Пусть он покрывает травы примерно на дюйм.
    2. Повторите шаг 1.3.
  6. Вторая фильтрация
    1. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2.
    2. Вылейте второй отвар в тот же стакан. Смешайте первый и второй отвары вместе.
  7. концентрация
    1. Поместите стакан на газовую плиту с сеткой из асбеста без проволоки между ними, нагреть отвар с помощью небольшого кипения и медленно и непрерывно перемешать стеклянным стержнем.
    2. Когда отвар уменьшают до 200 мл, перенесите его в 500-мл стакан.
    3. Повторите шаг 1.7.1 до тех пор, пока отвар не уменьшится до 100 мл.
  8. Хранение и администрирование
    1. Перенесите концентрированный отвар в стерильную стеклянную бутылку. Пусть он охлаждается до комнатной температурыRe (RT). Хранить при температуре 4 ° C при использовании в течение одной недели или при -70 ° C для длительного хранения.
    2. Используя иглу для желудка, вводите 0,14 мл / мышь отвара мышам с овариэктомией (OVX) один раз в день, 5 дней в неделю в течение 12 недель.

2. Протокол II: Получение EXD-содержащей сыворотки

  1. расчет
    1. Рассчитайте эквивалентную дозу крысы (RED), используя 0,15 кг в качестве массы тела каждой крысы (1 месяц): дБ = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / кг / сут.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 100 мл культуральной среды (10% EXD-содержащей сыворотки) требуется 10 мл сыворотки, содержащей EXD. Ожидается, что каждая крыса будет содержать 2 мл сыворотки. Таким образом, 6 крыс (20% потерь принимается во внимание) необходимы для приема EXD один раз в день в течение 3 дней. Количество EXD: (0.111 EXD / кг • день) * (0,15 кг / крыса) * (6 крыс) * (3 дня) = 0,300 EXD. Опять же, поскольку EXD измеряются дискретными приращениями,Используйте 1 EXD.
    2. Рассчитайте объем EXD, нанесенного на крысу ( т. Е. V = (0.111 EXD / кг • день) * (0,15 кг / крыса) * (50 мл / EXD) = 0,83 мл / крыса • день).
  2. намокание
    1. Поместите сырье для 1 EXD в контейнер с крышкой. Мацевать сырые травы в дистиллированной воде в течение 1 часа; Вода должна покрывать травы примерно на дюйм. Пусть все травы полностью впитаются.
  3. Первый отвар воды
    1. Нагрейте травы, используя индукционную плиту на высокой мощности до тех пор, пока вода не закипит (около 5-10 минут, временной интервал зависит от тепловой мощности, емкости, количества трав и воды). Поверните питание до низкого кипячения в течение 2 часов.
  4. Первая фильтрация
    1. Накройте стеклянный стакан емкостью 500 мл с обычной фильтровальной бумагой или с марлей и хлопка. Осторожно вылейте отвар в стакан через фильтр. Оставьте травы в контейнере.
  5. Второй отвар воды
    1. Добавить дистиллированную воду в контейнер с травами; Пусть он покрывает травы примерно на дюйм.
    2. Повторите шаг 2.4.
  6. Вторая фильтрация
    1. Повторите шаги 2.5.1 и 2.5.2.
    2. Вылейте второй отвар в тот же стакан, что и на шаге 2.4.1, и смешайте первый и второй отвары вместе.
  7. концентрация
    1. Поместите стакан на газовую плиту с сеткой из асбеста без проволоки между ними, нагреть отвар с помощью небольшого кипения и медленно и непрерывно перемешать стеклянным стержнем.
    2. Когда отвар уменьшает до 100 мл, переведите его в стакан емкостью 100 мл.
    3. Повторите шаг 2.7.1, пока отвар не уменьшится до 50 мл.
  8. Хранение и администрирование
    1. Перенос концентрированного отвара в стерильныйIle стеклянная бутылка. Пусть он охлаждается до RT. Хранить при температуре 4 ° C при использовании в течение одной недели или при -70 ° C для длительного хранения.
    2. Внутрижелудочно вводить 0,83 мл / крысу один раз в день в течение 3 дней.
  9. EXD-содержащий сывороточный препарат
    1. Анестезируйте крыс путем внутрибрюшинного введения 300 мл / 100 г 80 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина через 1 час после последнего введения EXD. Подтвердите правильную анестезию пальцем.
    2. Сожмите кожу и брюшину крысы от живота до нижней части грудной клетки, используя скальпель (или прямые операционные ножницы). Создайте разрез длиной и глубиной около 5 см и 0,5 см соответственно. Переместите брюшные внутренние органы в левую сторону, используя салфетку.
    3. Используя салфетку, удалите соединительную ткань брюшной аорты, чтобы четко разоблачить сосуд.
    4. Нанесите кровь медленно из брюшной аорты с помощью шприца с размерами 10 мл, 22 калибра. Передайте его15 мл стерильной трубки после удаления иглы; Одна крыса может продуцировать 8-10 мл крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Крыса должна быть живой ( т. Е. При пульсации брюшной аорты), когда начинается рисование крови и мертвые после завершения рисунка.
    5. Сгустите кровь в вертикальном положении в течение 30-60 мин в помещении RT. Центрифуга при 500-600 мкг в течение 20 мин. Осторожно поместите весь супернатант (сыворотку) в одну стерильную пробирку на 50 мл и смешайте всю сыворотку (от разных животных) вместе.
    6. Выполните инактивацию тепла, инкубируя сыворотку в водяной бане с температурой 56 ° C в течение 30 мин. Отфильтруйте сыворотку с помощью шприцевого фильтра с гидрофильной полиэфирсульфоновой мембраной размера пор 0,22 мкм. Используйте сыворотку свежей или хранить ее при -20 ° C.
  10. Контролирующее лекарственное средство, содержащее сыворотку (используемое в контрольной группе)
    1. Администрируйте каждую крысу с тем же объемом физиологического раствора (0,83 мл) один раз в день в течение 3 дней. Другие шаги такие же, как на шаге 2.9.
  11. заявка
    1. Добавьте 10 мл сыворотки, содержащей EXD, или содержащую лекарственное средство сыворотку в каждую 100 мл среды, плюс 1% пенициллина-стрептомицина (PS) 23 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффект EXD на плотность костей мышей OVX

Гематоксилин и эозин (H & E) окрашивание поясничного отдела позвонков показывает увеличенные костные трабекулы после обработки EXD in vivo ( рис. 1A , правая панель) по сравнению с группами в группе OVX ( рис. 1A , левая панель). На рисунке 1B показаны типичные изображения μCT 4 -го поясничного отдела у мышей OVX ( рис. 1B , левая панель) и мыши OVX с обработкой EXD в течение 12 недель ( рис. 1B , правая панель). В поясничном позвонке EXD-обработанных мышей наблюдаются более трабекулярные кости, чем мыши контрольных OVX. Данные из изображения μCT указывают на увеличение объема кости / объема ткани (BV / TV), трабекулярного числа (Tb. N) и толщины трабекулы (Tb Th) и уменьшения трабекулярного интервала (Tb. Sp) 4 -го поясничного В мышах EXD ( рисунок 1С ).

Влияние EXD на остеогенез костных мезенхимальных стволовых клеток (bMSCs) у мышей OVX

На рисунке 2 представлен остеогенный потенциал bMSC. Жирные капли (звездочка, неправильная форма липидной капли) автоматически образуются, когда bMSC мышей OVX культивируют в течение 7 дней ( рис. 2А , левая панель). У мышей, обработанных EXD, вместо жировой капли образуются костяные конкреции (стрелка) ( рис. 2В , правая панель). Анализ щелочной фосфатазы (ALP) демонстрирует, что в обработанных с помощью EXD ​​bMSCs ( рис. 2B , правая панель) может быть обнаружено большее количество ALP-позитивных клеток (фиолетовый) по сравнению с таковыми в bMSC от контрольных мышей OVX ( рисунок 2B , левая панель).

Изменения экспрессии генов между OVX и EXD-мышамиs = "Xref"> 24

Иерархическая кластеризация показывает, что экспрессия 389 генов, обнаруженных микрочипом в bMSC, была изменена с изменением (> 1,5, нормализована не-OVX-мышами) между OVX и обработанными EXD мышами in vivo (всего: 26 991 генов) ( рисунок 3 ). Зеленый указывает, что выражение было активировано, а красный указывает, что выражение было подавлено. Три образца в одной группе сначала группируются вместе, что указывает на надежные качества профиля. На рисунке 4 показан перекрываемый сигнальный путь, предназначенный EXD, как in vivo , так и in vitro .

Рисунок 1
Рисунок 1: Влияние EXD на морфологию костей.
( A ) H & E-окрашивание поясничной 4 -й секции мышей, обработанных OVX и EXD. ( -й трабекулярной кости у контрольных мышей OVX и EXD. ( C ) Количественная оценка μCT. BV: объем кости, TV: объем ткани, Tb.N: трабекулярное число, Tb.Th: толщина трабекулы и Tb.Sp: трабекулярное расстояние. Колонки представляют собой средства ± SE. N = 6 на группу. * P <0,05, ** p <0,01 EXD по сравнению с OVX (t-критерий Стьюдента). ( AC ) были модифицированы из Shufen Liu et al. 24. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Влияние EXD на дифференциацию bMSC.
( A ) Изображения bMSCs, культивированные в течение 7 дней после beiNg, выделенных из бедра OVX или обработанных EXD мышей. * Указывает на жирную каплю. Стрелка указывает на узел кости. ( B ) окрашивание ALP обработанных OVX и EXD bMSCs, культивированных в течение 7 дней (фиолетовый представляет собой ALP-положительный). ( C ) Количественная оценка ( B ). Колонки представляют собой средства ± SE из трех блюд (шесть мышей) на группу. ** p <0,01 EXD по сравнению с OVX (t-тест ученика). ( AC ) были модифицированы из Shufen Liu et al. 24. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Влияние EXD на профиль экспрессии генов.
Тепловая карта иерархической кластеризации экспрессии 389 генов в OVX и EXD bMSCs Собранных на 7 -й день после диссоциации. Масштаб (маленькое изображение) указывает изменения смены, нормированные не-OVX bMSC. Список генов приведен в дополнительном файле 1 . Эта фигура была модифицирована Shufen Liu et al. 24. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Влияние EXD на путь перекрывающейся сигнализации в экспериментах In Vivo и In Vitro .
Первые 10 перекрытых сигнальных путей, которые инвертируются EXD in vivo и EXD-содержащей сывороткой in vitro на основе пути KEGG. Гены, связанные с путями, показаны в дополнительном файле 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

вид мышь крысиный морская свинка Кролик Кот Обезьяна Собака Человек
р 59 90 99 93 82 111 104 100

Таблица 1: R-фактор в разных видах.
R-фактор у 8 видов, которые обычно используются в фармакологических исследованиях. R-фактор пропорционален: (площадь поверхности тела (м 2 ) / bВес оды (кг)) 2/3 .

Дополнительный файл 1.
Информация о 389 генах, которые регулируются или понижаются, в 1,5 раза, но спасены EXD in vivo . Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2.
Информация о сигнальном пути (на основе пути KEGG) и связанных генах как в экспериментах in vivo, так и in vitro . Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В последние годы больше внимания уделяется травяным лекарствам, одним из видов альтернативной медицины, которые применялись в клинических условиях в Восточном мире в течение тысяч лет. В отличие от «современной скамьи на кровать» современной медицины, традиционная травяная медицина сначала требует шаблона «кровать для скамейки», чтобы объяснить их механизмы. За этим может последовать валидация, выполняемая на стенде и обработка для разработки новых оптимизированных препаратов. До сих пор существует несколько методов экстракции, которые были доведены до сведения активных компонентов высвобождения из целых формул или лекарственных растений. Среди них наиболее широко используется вододобыча.

Водная экстракция лекарственных растений имеет четыре основных этапа. Первый шаг - замачивание. Сложная травяная медицина мацерируется в воде в течение определенного периода времени, обычно от 0,5 до 1 часа. Время просачивания зависит от количества и свойств сырых трав. кУбедитесь, что сырые травы тщательно пропитаны, центр каждой части или блока должен быть погружен. Объем воды зависит от общего объема трав. Иногда вес трав используется для определения того, сколько воды требуется для вымачивания. Тем не менее, плотность трав сильно различается. Поскольку целью замачивания является удаление всех трав, способствующих высвобождению активных компонентов на следующих этапах, объем трав предпочтительнее для использования в качестве эталонного стандарта для объема воды. Второй шаг - приготовление пищи. Кипящие и кипящие процессы были разработаны за тысячи лет. Изменение времени приготовления зависит главным образом от вида трав из-за их различных физических, химических и фармакологических характеристик 12 . Диафоретики рекомендуется готовить в течение короткого периода времени, обычно менее 20 минут, в то время как ароматические соединения следует добавлять всего за несколько минут до первого кипения, чтобы избежать летучих реакций. FИли тонизирующие травы, требуется длительный период времени для выщелачивания их терапевтических компонентов. В этом случае EXD используется для лечения постменопаузального остеопороза в течение десятилетий 12 . В традиционной китайской медицине этот синдром считается вызванным дефицитом почек. EXD в основном предназначен для тонизирования почек. Поэтому EXD готовят в течение 2 - 3 ч, чтобы EXD мог оказывать антиостеопоротическое действие 15 . Третий этап - фильтрация. Фильтрация помогает предотвратить засорение иглы в желудке травяными гранулами. Четвертый шаг - концентрация. Необходимо тщательно изучить объем введения в желудочный зонд. Сообщалось, что большие объемы, такие как 10 мл / кг или более, вводимые пероральным желудочным зондом, могут приводить к нескольким проблемам, связанным с абсорбцией, включая быстрое шунтирование соединений в двенадцатиперстную кишку или аспирационную пневмонию, связанную с пассивным рефлюксом МатерияЛ в пищевод 25 . Таким образом, объемы, выбранные для мышей и крыс, составляли примерно 7,5 мл / кг и 5,5 мл / кг соответственно.

Важно подтвердить, являются ли эффективные компоненты переваренного и метаболизированного EXD в крови похожими на эффективные компоненты сырого экстракта. Что касается биоэквивалентности EXD, Wu et al. Сообщили об определении 7 компонентов в собачьей плазме: эпимедин А, эпимедин В, эпимедин С, икариин, сагиттатозид В, 2 "-О-рамнозил-икаризид II и баооозид I 26 . Hu et al. Обнаружили 21 соединение в плазме крыс после перорального введения 27 . До сих пор необработанный экстракт из EXD не сообщался. Однако некоторые из эффективных компонентов, протестированных в крови, таких как икариин и берберин, были непосредственно применены к животным для сравнительного наблюдения 28 .

Существует несколько подходов к вычислению биоэлементов животныхКвивалентная доза. Традиционный метод, основанный на весе тела (мг / кг), не подходит, поскольку фармакокинетика различна у разных видов. Часто используется расчет, основанный на площади поверхности тела (мг / м 2 ), в которой скорость метаболизма связана с отдельным размером животных. Приведенное здесь уравнение учитывает как площадь поверхности тела, так и массу тела и обычно используется в традиционной китайской медицине 30 .

Многие виды животных, такие как кролики, морские свинки, крысы и мыши, могут быть выбраны для препарата, содержащего сыворотку. Предпочтительным является тот же вид, что и клетки, обработанные in vitro . В этом исследовании крысы были выбраны, потому что они обеспечивают больше сыворотки, чем мышам, и ближе к мышам по видам по сравнению с другими животными. Кроме того, рекомендуется использовать эквивалент дозы в in vivo или клинике, как показал протокол in vitro . РазбавлениеИон сыворотки (рекомендуется 1:10) не учитывается; То есть 10-кратная эквивалентная доза не применяется к животным, содержащимся в сыворотке, из-за потенциальной токсической реакции, вызванной обработанными клетками или органами 31 . Частота введения препарата варьируется от одного раза в день в течение от 3 до 14 дней до двух раз в день (2 часа между каждой администрацией) 7 , 8 , 32 . Время сбора обычно происходит между часами 1 и 2 (до часа 6) после последней администрации 33 , 34 . Цель состоит в том, чтобы концентрация препарата в крови была относительно стабильной и на ее пиковом уровне, когда были собраны образцы 35 . Процедуры введения могут включать инъекцию, введение в кожу или ингаляцию в соответствии с процедурами введения in vivo .

Инактивация лекарственно-Содержащая сыворотку, по-прежнему вызывает споры. Сторонники считают, что присутствие многих активных компонентов, таких как гормоны, ферменты, антитела и дополнения в самой сыворотке, может привести к неожиданным реакциям, которые влияют на результаты 36 . Оппозиция считает, что активные компоненты, производимые наркотиками, также могут быть удалены процессом инактивации 37 . Чтобы сбалансировать это, люди разрабатывают контрольную группу таким образом, что используется сыворотка от физиологически обработанных животных.

Существуют некоторые ограничения для протокола. Качество экстракта не оценивается перед началом экспериментов in vivo и in vitro . Во-вторых, в культуральной среде используются антибиотики, которые могут вызывать взаимодействия с лекарственными средствами и требуют дальнейшего тестирования. В-третьих, время вымачивания и кипения определяется на основе опыта, полученного из клинической практики и экспериментов на животных. Можно выбрать более длительные периоды времени fИли сравнения. Время вымачивания и варки может быть изменено для разных лекарственных трав. Объем отвара для введения животного может быть изменен в зависимости от вида и возраста и веса животного. Животное, выбранное для приготовления лекарственно-содержащей сыворотки и для процедур введения, может быть изменено, как обсуждалось выше.

В совокупности протокол и результаты служат примером для подготовки и применения травяного отвара в исследованиях in vivo и in vitro . В разных случаях некоторые детали должны быть оптимизированы, включая периоды лечения, виды и процедуры введения, основанные на травяных характеристиках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (81573992). Мы благодарим Эмили К. Ло и Кэтлин ДиНаполи за помощь в редактировании языка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) 160922 EXD components
Filter paper GElifesciences 99-103-952 Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 In vivo study
Sprague Dawley rats Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 EXD-containing serum preparation
Syringe filter Millipore SLGP033RB 0.22 µm
gavage needles (10 ml) Shanghai BO Ge trade sales department 59104274 Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)  Fujian Gutian Pharma Co. Ltd H35020148 Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg) Sunway Pharma Co. Ltd CB07591 Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium Gibco 12800-116 DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin Sigma 1277 100 µg / ml
Penicillin Sigma 4687 100 µg / ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
  2. Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
  3. Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
  4. Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
  5. Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
  6. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
  7. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
  8. Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
  9. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
  10. Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
  11. Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
  12. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  13. Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
  14. Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
  15. Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
  16. Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
  17. Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
  18. Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
  19. Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
  20. Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
  21. Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
  22. Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
  23. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  24. Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
  25. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  26. Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
  27. Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
  28. Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
  29. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  30. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  31. Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
  32. Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
  33. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  34. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  35. Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  36. Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  37. Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).

Tags

Медицина выпуск 123 отвар er-xian лекарственная сыворотка сывороточная фармакология фитотерапия интегративная медицина традиционная китайская медицина,
Подготовка травяной медицины: Er-Xian Decoction и Er-Xian-содержащая сыворотка для<em&gt; В Виво</em&gt; И<em&gt; In Vitro</em&gt; Эксперименты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J.,… More

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55654, doi:10.3791/55654 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter