Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הכנה של צמחי מרפא: Er-Xian מרתח ו Er-Xian המכיל בסרום עבור Published: May 31, 2017 doi: 10.3791/55654
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2The Academy of Integrative Medicine of Fudan University

Summary

כאן, אנו מציגים את ההכנה של מרתח א-שיאן (EXD) בארבעה שלבים - השריה, מרתח, סינון וריכוז - ומדגימים את הניהול של סרום מכין EXD מוכן לחולדות. שיטות אלה חלים על in vivo ובמחקר חוץ גופית של decoctions צמחים כגון תרופות סיניות מסורתיות.

Abstract

צמחי מרפא מסורתיים, רפואה אלטרנטיבית בקליניקה הקלינית, זכו לתשומת לב מוגברת בשנים האחרונות. לפני המסירה לגוף, הליך החילוץ הנוסף נדרש בדרך כלל לשחרר את המרכיבים הפעילים מעשבי תיבול. מרתח מים הוא הליך החילוץ הקלאסי, כי הוא עדיין בשימוש נרחב בהגדרות הקליניות. כאן, אנו מציעים פרוטוקול מפורט עבור er-xian מרתח (EXD) על מנת ליישם decoctions צמחים למחקרים ניסיוניים. חישוב המינון המתאים לבעלי חיים מתואר, כמו גם את ארבעת השלבים העיקריים של EXD: השריה, מרתח מים, סינון, וריכוז. בנוסף, EXD המכיל בסרום הוא הציג חולדות כאמצעי אימות במבחנה . הנה, חולדות היו מנוהלים בעל פה EXD במשך שלושה ימים. לאחר מכן נאספו דגימות דם, הופעלו, צנטריפוגה, וסוננו. סרום, מדולל עם המדיום התרבות, ניתן להשתמש כדי לטפל בתאים או רקמות ב VJ less לדוגמה, EXD הוחל הן על vivo והן במבחנה מחקרים הוכיח כי EXD משפר osteogenesis. פרוטוקול זה יכול לשמש הפניה להכנת ויישום של תרופות צמחיות.

Introduction

עניין במחקר ויישום של צמחי מרפא מסורתיים כיום גדל. בניגוד לתרופות מודרניות, שבהן מרכיבים כימיים מוגדרים, נוסחאות צמחיות כוללות חומרים לא ידועים ודורשות תהליכי מיצוי על מנת לאפשר את אספקת המרכיבים הפעילים שלהם. למרות שמחקרים רבים מנסים לבחור תרכובת קטנה אחת עם מבנה ידוע כמייצג של כל העשב או נוסחת צמחים, לא יעילות pharmacological ולא מנגנונים יכול להיחשב שווה 1 , 2 . בעוד טביעת אצבע מאפשרת ניתוח של המרכיבים של צמחי מרפא מורכבים, כמה המרכיבים עדיין לא ניתח בבירור, מה שמוביל אתגר כאשר שילוב של כל תמציות עבור מחקר 3 . האינטראקציות של המרכיבים / תמציות רבים מתווכים את ההשפעות הטיפוליות של תרופות צמחיות. כדי לשמור על יתרון זה, לחלץ את הטופס המסורתי decoct יון - עדיין בשימוש נרחב במרפאה. מאז הליך החילוץ יש השפעה רבה על יעילות טיפולית, פרוטוקול סטנדרטי של מרתח מים מסורתי הוא הכרחי, במיוחד עבור vivo מחקרים 4 , 5 .

מצד שני, כאשר חוקרים מנגנונים פרמקולוגיים, ניהול של צמחים decoctions במהלך במבחנה או vivo לשעבר מחקרים גם אתגר. הרעיון של סרום המכיל סמים הוצע לראשונה על ידי Tashino בשנת 1988 6 . מאז, מספר גדל והולך של חוקרים יש להחיל אותו על תרופות צמחיות 7 , 8 , 9 . למרות שלשימוש בסרום המכיל סמים יש מגבלות מסוימות, כגון השפעתם של מרכיבים מסוימים של הסרום, היא עדיין נחשבת כשיטה המחקה מקרוב את התנאים הפיזיולוגיים.

"Jove_content"> תמצית אר-שיאן פותחה בתחילת שנות החמישים כדי להקל על תסמיני גיל המעבר 10 , 11 , 12 , 13 . זה גם הוחל על הטיפול של anaemia 14 , אוסטיאופורוזיס גיל המעבר 15 , 16 , 17 , כישלון שחלות מוקדמות 18 , סרטן השד 19 , סרטן השחלות 20 , בגיל ההתבגרות מאוחרת 21 . כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת שני ero-xian מרתח (EXD) ואת סרום המכיל סרום. בנוסף, אנו מתארים את היישום של EXD ו- EXD המכילים בסרום מודלים מוראופאוס אוסטיאופורוטיות.

EXD מורכב מ 9 גרם כל אחד Orcioides Orchioides Curculigo , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis , ו- Radix Angelicae Sinensis ו- 6 גרם כל אחד מקליפת Phellodendri ו- Rhizoma Anemarrhenae למטופל מבוגר ליום. המינון המקביל לעכבר הוא 0.1418 EXD / kg / day בהתבסס על המשוואה הבאה 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA ו- dB מתייחסים למינון לכל משקל גוף (mg / kg) של האדם והעכבר, בהתאמה. המינון, במ"ג / ק"ג, מוחלף במספר EXD / kg. RA ו- RB מייצגים את גורם הגוף האנושי ואת גורם הגוף העכבר, בהתאמה, אשר פרופורציונלי ל (שטח משטח הגוף (m 2 ) / משקל גוף (ק"ג)) 2/3 (ראה טבלה 1 ). WA ו WB מצביעים על bodyweight (ק"ג) של האדם והעכבר, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת שנחאי של הרפואה הסינית המסורתית והוא אושר על ידי הניסוי בבעלי חיים שנחאי ועדת האתיקה של בעלי חיים.

1. פרוטוקול I: הכנת EXD

  1. תַחשִׁיב
    1. ניהול EXD לקבוצת טיפול של 10 בן שישה חודשים נקבה טביעת נקבה אזור בקרת (ICR) עכברים (0.02 ק"ג / עכבר), 5 ימים בשבוע במשך 12 שבועות.
      הערה: סך של 1.702 EXDs נדרשים. בגלל EXDs נמדדים במרווחים נפרדים, בפועל בפועל, לנהל 2 EXDs.
    2. חישוב עוצמת הקול של EXD להחיל לכל העכבר ( כלומר V = (0.1418 EXD / kg • יום) * (0.02 ק"ג / עכבר) * 50 מ"ל / EXD = 0.14 מ"ל / עכבר ביום).
  2. שְׁרִיָה
    1. לשים את כל חומרי הגלם של שני EXDs ( כלומר, Curculigo Orchioides גארטן (18 גרם), Herbaa Epimedii (18 גרם), Radix Morindae Officinalis (18 גרם), RAdix Angelicae Sinensis (18 גרם), קורטקס Phellodendri (12 גרם), ו Rhizoma Anemarrhenae (12 גרם), 96 גרם בסך הכל) לתוך מיכל עם מכסה.
      הערה: מומלץ להשתמש במכל קרמי.
    2. מסיר את עשבי תיבול גלם עם 500 מ"ל של מים מזוקקים במשך 1 שעות; המים צריכים לכסות את עשבי התיבול בסנטימטר. תן את כל עשבי תיבול ביסודיות.
  3. הראשון מרתח מים
    1. מחממים את עשבי התיבול באמצעות תנור גז או תנור אינדוקציה על כוח גבוה עד המים רותח (כ 5 - 10 דקות, משך הזמן תלוי כוח החימום, מיכל, ואת כמות עשבי תיבול ומים). סובבו את ההספק למבשיל נמוך למשך 2 שעות.
  4. סינון ראשון
    1. מכסים כוס 500 מ"ל כוס עם נייר סינון רגיל או עם גזה וכותנה. בזהירות לשפוך את מרתח לתוך כוס דרך המסנן. משאירים את העשבים במיכל.
    2. החזר את שארית הצמחים הנותריםN נייר הסינון למכולה.
  5. מרתח מים שני
    1. מוסיפים מים מזוקקים למיכל עם עשבי תיבול; לתת לזה לכסות את עשבי תיבול על ידי סנטימטר.
    2. חזור על שלב 1.3.
  6. סינון שני
    1. חזור על שלבים 1.4.1 ו 1.4.2.
    2. יוצקים את מרתח השני לתוך אותו כוס. מערבבים יחד את שני decoctions הראשון.
  7. ריכוז
    1. מניחים את הכוס על סיר גז עם גזה תיל ללא אסבסט ביניהם, לחמם את מרתח באמצעות רתיחה נמוכה, לאט לאט ברציפות עם מוט זכוכית.
    2. כאשר מרתח מפחית ל 200 מ"ל, להעביר אותו כוס 500 מ"ל.
    3. חזור על שלב 1.7.1 עד מרתח מפחית ל 100 מ"ל.
  8. אחסון וניהול
    1. מעבירים את מרתח מרוכז בקבוק זכוכית סטרילית. תן לזה להתקרר לחדר temperatu(RT). חנות ב 4 ° C אם תוך שבוע או ב -70 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    2. באמצעות מחט gavage, לנהל 0.14 מ"ל / עכבר של מרתח כדי ovariectomized (OVX) עכברים פעם ביום, 5 ימים בשבוע במשך 12 שבועות.

2. פרוטוקול II: הכנת EXD המכיל סרום

  1. תַחשִׁיב
    1. לחשב את המינון השווה של חולדה (RED) באמצעות 0.15 ק"ג כמשקל הגוף של כל חולדה (חודש אחד): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / ק"ג / יום.
      הערה: סך של 10 מ"ל של EXD המכיל בסרום יש צורך להכין 100 מ"ל של המדיום תרבות (10% EXD המכילים בסרום). כל חולדה צפויה לספק 2 מ"ל של סרום. לכן, 6 עכברושים (הפסד 20% נלקח בחשבון) נדרשים לניהול EXD פעם ביום במשך 3 ימים. מספר EXDs הוא: (0.111 EXD / kg • יום) * (0.15 ק"ג / חולדה) * (6 חולדות) * (3 ימים) = 0.300 EXD. שוב, כי EXDs נמדדים במרווחים נפרדים,השתמש 1 EXD.
    2. לחשב את נפח EXD מיושם לכל חולדה ( כלומר, V = (0.111 EXD / ק"ג יום) * (0.15 ק"ג / חולדה) * (50 מ"ל / EXD) = 0.83 מ"ל / חולדה • יום).
  2. שְׁרִיָה
    1. שים את חומרי הגלם עבור 1 EXD לתוך מיכל עם מכסה. מסיר את עשבי תיבול גלם במים מזוקקים במשך 1 שעות; המים צריכים לכסות את עשבי התיבול בסנטימטר. תן את כל עשבי תיבול ביסודיות.
  3. הראשון מרתח מים
    1. מחממים את עשבי תיבול באמצעות סיר אינדוקציה על כוח גבוה עד המים רותח (כ 5 - 10 דקות, משך הזמן תלוי כוח החום, מיכל, ואת כמות עשבי תיבול ומים). סובבו את ההספק עד לשעה נמוכה עבור 2 שעות.
  4. סינון ראשון
    1. מכסים כוס 500 מ"ל כוס עם נייר סינון רגיל או עם גזה וכותנה. בזהירות לשפוך את מרתח לתוך כוס דרך המסנן. משאירים את העשבים במיכל.
  5. מרתח מים שני
    1. מוסיפים מים מזוקקים למיכל עם עשבי תיבול; לתת לזה לכסות את עשבי תיבול על ידי סנטימטר.
    2. חזור על שלב 2.4.
  6. סינון שני
    1. חזור על שלבים 2.5.1 ו -2.5.2.
    2. יוצקים את מרתח השני לתוך אותו כוס כמו בשלב 2.4.1 ומערבבים את decoctions הראשון והשני יחד.
  7. ריכוז
    1. מניחים את הכוס על כיריים גז עם גזה חוט ללא אסבסט ביניהם, לחמם את מרתח באמצעות רתיחה נמוכה, לאט לאט ברציפות עם מוט זכוכית.
    2. כאשר מרתח מפחית ל 100 מ"ל, להעביר אותו כוס 100 מ"ל.
    3. חזור על שלב 2.7.1 עד מרתח מפחית 50 מ"ל.
  8. אחסון וניהול
    1. מעבירים את מרתח מרוכז לתוך סטריבקבוק זכוכית אייל. תן לזה להתקרר RT. חנות ב 4 ° C אם תוך שבוע או ב -70 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    2. Intragastrically לנהל 0.83 מ"ל / חולדה פעם ביום במשך 3 ימים.
  9. EXD המכיל הכנה בסרום
    1. להרדים את החולדות על ידי הזרקת intraperitoneally של 300 מ"ל / 100 גרם של 80 מ"ג / ק"ג קטמין ו 10 מ"ג / ק"ג xylazine בשעה 1 אחרי הממשל האחרון של EXD. אישור הרדמה נכונה על ידי קמצוץ אצבע.
    2. לחתוך את העור ואת הצפק של החולדה מהבטן לתחתית בית החזה באמצעות אזמל (או מספריים הפעלה ישר). יצירת חתך של אורך ועומק של כ 5 ס"מ ו 0.5 ס"מ, בהתאמה. להזיז את הקרביים הבטן משמאל באמצעות נייר טישו.
    3. באמצעות נייר רקמות, להסיר את רקמת החיבור של אבי העורקים הבטן לחשוף בבירור את כלי השיט.
    4. צייר את הדם לאט מן אבי העורקים הבטן באמצעות מזרק 10 מ"ל, 22-מד. להעביר אותוצינור 15 סטרילי סטרילי לאחר הסרת המחט; חולדה אחת יכולה לייצר 8-10 מ"ל של דם.
      הערה: החולדה צריכה להיות חיה ( כלומר, עם אבי העורקים הבטן פועם) כאשר מתחילים את ציור הדם ומת לאחר סיום הציור.
    5. קריש הדם במצב זקוף במשך 30 - 60 דקות בחדר RT. צנטריפוגה ב XG 500-600 במשך 20 דקות. בזהירות במקום את כל supernatant (בסרום) בצינור 50 מ"ל סטרילי אחד לערבב את כל הסרום (מבעלי חיים שונים) יחד.
    6. בצע איטום החום על ידי דוגרים את הסרום באמבט מים 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מסנן את הסרום באמצעות מסנן מזרק עם 0.22 מיקרומטר נקבוביות גודל הידרופילי polyethersulfone קרום. השתמש בסרום טרי או לאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
  10. תכשירים המכילים תרופה בסרום (המשמשים בקבוצת הביקורת)
    1. ניהול כל חולדה עם נפח זהה של מלוחים (0.83 מ"ל) פעם ביום במשך 3 ימים. השלבים האחרים הם כמו בשלב 2.9.
  11. יישום
    1. הוסף 10 מ"ל של EXD המכיל בסרום או בסרום המכיל בסרום לכל 100 מ"ל של המדיום, בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין (PS) 23 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההשפעה של EXD על צפיפות העצם של עכברי OVX

מכתבים של heatoxylin ו eosin (H & E) של סעיף החוליה המותני מראה גדל trabeculae העצם לאחר טיפול EXD ב vivo ( איור 1 א , פאנל ימין) לעומת אלה בקבוצת OVX ( איור 1 א , פאנל שמאל). איור 1B מציג את התמונות μCT נציג של 4 המותני 4 בעכברים OVX ( איור 1 ב , פאנל שמאל) ועכברי OVX עם טיפול EXD במשך 12 שבועות ( איור 1B , הפאנל הימני). עצמות trabecular יותר נראים בתוך החוליה המותני של עכברים שטופלו EXD מאלה של שליטה OVX עכברים. הנתונים מדגימת ה- μCT מצביעים על נפח מוגבר של נפח עצמות / רקמות (BV / TV), מספר trabecular (Tb N) ועובי trabecular (Tb) ו ירידה בריבוע trabcular (Tb. Sp) של המותניים 4 ב עכברים EXD ( איור 1 ג ).

ההשפעה של EXD על אוסטאוגנזה של תאי גזע mesenchymal עצם (bMSCs) מ OVX עכברים

איור 2 מייצג את הפוטנציאל osteogenic של bMSCs. טיפות שומן (כוכבית, צורה לא סדירה של טיפת השומנים) נוצרים באופן אוטומטי כאשר bMSCs של עכברים OVX מתורבתים במשך 7 ימים ( איור 2 א , פאנל שמאל). ב EXD שטופלו עכברים, גושים עצמות (חץ) נוצרים במקום טיפת שומן ( איור 2 ב , הפאנל הימני). אלספליין phosphatase (ALP) assay מדגים כי יותר ALP חיובי תאים (סגול) ניתן לזהות ב - BMSCs שטופלו EXD ( איור 2B , פאנל ימין) לעומת אלה ב bMSCs מ שליטה עכברי OVX ( איור 2 ב , פאנל שמאל).

השינויים ביטוי גנים בין OVX ו עכברים EXDS = "xref"> 24

קיבוץ היררכי מראה כי ביטוי של 389 גנים שנחשפו על ידי microarray ב bMSCs היה לקפל שונה (> 1.5, מנורמל על ידי עכברים שאינם OVX) בין OVX ו EXD שטופלו עכברים in vivo (סה"כ: 26,991 גנים) ( איור 3 ). ירוק מציין כי הביטוי היה upregulated, בעוד אדום מציין כי הביטוי היה downregulated. שלוש דגימות באותה קבוצה מקובצות יחד תחילה, ומציינות את התכונות המהימנות של הפרופיל. איור 4 מציג את מסלול האיתות החפיפה שממוקד על ידי EXD, הן in vivo והן במבחנה .

איור 1
איור 1: השפעת EXD על מורפולוגיה העצם.
( א ) מכתים H & של החלק 4 המותני של OVX ו EXD שטופלו עכברים. ( ג ) כימות של μCT. BV: נפח העצם, טלוויזיה: נפח רקמות, Tb.N: מספר trabecular, Tb.Th: עובי trabecular, ו Tb.Sp: המרווח trabecular. העמודות מייצגות את האמצעים ± SE. N = 6 לכל קבוצה. * P <0.05, ** p <0.01 EXD לעומת OVX (מבחן הסטודנט של התלמיד). ( AC ) שונה מ Shufen Liu et al. 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: השפעת EXD על בידול bMSC.
( א ) תמונות של bmsCs מתורבת במשך 7 ימים לאחר בייNg מבודד את עצם הירך של עכברים OVX או EXD שטופלו. * מציין אגל שמן. חץ מציין גבעול עצם. ( B ) מכתים ALP של OVX ו- EXD שטופלו bMSCs מתורבת במשך 7 ימים (סגול מייצג ALP חיובי). ( ג ) כימות ( ב ). עמודות מייצגים את האמצעים ± SE משלוש מנות (שישה עכברים) לכל קבוצה. ** p <0.01 EXD לעומת OVX (סטודנט של מבחן T). ( AC ) שונה מ Shufen Liu et al. 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: השפעת EXD על פרופיל ביטוי ג 'ין.
Heatmap של קיבוץ היררכי של ביטוי של 389 גנים OVX ו EXD bMSCs שנקטפו ביום השביעי שלאחר הפינוי. קנה המידה (תמונה קטנה) מציין שינויים מקופלים מנורמלים שאינם ב- OVX bMSCs. רשימת הגנים מסופקת בקובץ משלים 1 . הדמות שונה מ Shufen Liu et al. 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ההשפעה של EXD על נתיב אותות חופפים בשני ויוו ו ניסויים במבחנה .
הראשון 10 חוצה נתיבי איתות היפוך על ידי EXD ב vivo ו EXD המכיל בסרום במבחנה מבוסס על מסלול KEGG. הגנים הקשורים לנתיבים מוצגים בקובץ משלים 2 ./ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. "Target =" _ blank "

מִין עכבר עכברוש חֲזִיר יָם אַרנֶבֶת חתול קוֹף כֶּלֶב בן אנוש
R 59 90 99 93 82 111 104 100

טבלה 1: R- גורם במינים שונים.
R- גורם 8 מינים המשמשים בדרך כלל במחקר פרמקולוגי. מקדם ה- R הוא פרופורציונלי ל: (שטח משטח הגוף (m 2 ) / bמשקל ody (ק"ג)) 2/3 .

קובץ משלים 1.
מידע על 389 גנים כי הם upregulated או downregulated פי 1.5 פי לקפל אבל EXD ב vivo . לחץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 2.
מידע על מסלול איתות (מבוסס על מסלול KEGG) וגנים קשורים הן in vivo והן בניסויים חוץ גופית . לחץ כאן להורדת הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשנים האחרונות הוקדשה תשומת לב רבה יותר לתרופות צמחיות, סוג אחד של רפואה אלטרנטיבית שהוחל בסביבה הקלינית בעולם המזרחי במשך אלפי שנים. שונה מן "הספסל למיטה" דפוס של הרפואה המודרנית, צמחי מרפא מסורתיים הראשון דורשים את "המיטה לספסל" דפוס להסביר את המנגנונים שלהם. זה יכול להיות ואחריו אימות שבוצעה בשלב הספסל ועיבוד לפיתוח של תרופות מותאמות החדש. עד כה, ישנן שיטות מיצוי מספר כי כבר דיווחו על שחרור רכיבים פעילים נוסחאות שלמות או עשבי תיבול. ביניהם, מיצוי מים הוא הנפוץ ביותר בשימוש.

מיצוי המים של תרופות צמחיות יש ארבעה שלבים בסיסיים. השלב הראשון הוא רטוב. תרופות צמחיות מורכבות הוא macerated במים לתקופה של זמן, בדרך כלל מ 0.5 עד 1 שעות. טווח הזמן עבור השריית תלוי בכמות ואת הרכוש של צמחי מרפא גלם. ללהבטיח כי עשבי תיבול גלם הם ספוגים היטב, במרכז של כל חתיכת או בלוק צריך להיות תלולה. נפח המים תלוי בנפח הכולל של עשבי תיבול. לפעמים, את המשקל של עשבי תיבול משמש כדי לקבוע כמה מים יש צורך להשרות. עם זאת, צפיפות עשב להשתנות במידה רבה. מאחר שמטרת השרייה היא לקרר את כל העשבים, דבר המקל על שחרור המרכיבים הפעילים במהלך השלבים הבאים, נפח העשבים המועדף לשימוש כסטנדרט התייחסות לכמות המים. השלב השני הוא בישול. תהליכי הרתחה ומריחה פותחו במשך אלפי שנים. השוני בזמן הבישול תלוי בעיקר בסוגי עשבי תיבול, בשל תכונותיו הגופניות, הכימיות והפרמקולוגיות השונות. דיאפורטים מוצעים לבשל במשך תקופה קצרה של זמן, בדרך כלל פחות מ 20 דקות, בעוד ארומטים יש להוסיף רק כמה דקות לפני הראשון רותחים, כדי למנוע תגובות תנודתי. Fאו טוניק עשבי תיבול, תקופה ארוכה של זמן נדרש כדי להבריח את המרכיבים הטיפולי שלהם. במקרה זה, EXD משמש לטיפול באוסטיאופורוזיס לאחר גיל המעבר במשך 12 שנים. בתיאוריה הרפואית הסינית המסורתית, תסמונת זו נחשבת לחוסר בכליות. EXD נועד בעיקר כדי tonify את הכליה. לכן, EXD היה מבושל עבור 2 - 3 שעות כדי לאפשר EXD להפעיל השפעות אנטי אוסטאופורוטיות שלה 15 . השלב השלישי הוא סינון. סינון מסייע למנוע מחט gavage מלהיות סתומים עם גרגרי צמחים. הצעד הרביעי הוא ריכוז. נפח של ניהול gavage יש לשקול בזהירות. זה כבר דיווחו כי כמויות גדולות, כגון 10 מ"ל / ק"ג או יותר, המנוהל על ידי gavage אוראלי יכול לגרום למספר בעיות הקשורות הספיגה, כולל shunting מהירה של תרכובות כדי תריסריון או דלקת ריאות דלקת הנשימה הקשורים reflux פסיבית של MateriaL לתוך הוושט 25 . לפיכך, הכרכים שנבחרו עבור עכברים וחולדות היו בסביבות 7.5 מ"ל / ק"ג ו 5.5 מ"ל / ק"ג, בהתאמה.

חשוב לוודא אם המרכיבים היעילים של EXD מתעכל metabolized בדם דומים לאלה של תמצית גלם. במונחים של ביו-אקווידיות ב- EXD, Wu et al. דיווחו על קביעת 7 מרכיבים בפלסמה לכלבים: epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin, sagittatoside B, 2 "-O-rhamnosyl icariside II, ו baohuoside אני 26 . Hu et al. נמצאו 21 מרכיבים בפלסמה חולפת לאחר מתן אוראלי 27 . עד כה, תמצית הגלם מ- EXD לא דווחה. עם זאת, חלק מהרכיבים היעילים שנבדקו בדם, כגון icariin ו- berberine, יושמו ישירות על בעלי חיים לצורך תצפית השוואתית.

ישנן מספר גישות לחישוב bioe בעלי חייםמינון quivalent. השיטה המסורתית המבוססת על bodyweight (mg / kg) אינה מתאימה משום הפרמקוקינטיקה להשתנות במינים שונים. החישוב המבוסס על שטח משטח הגוף (mg / m 2 ), שבו קצב חילוף החומרים קשור לגודל החיה היחיד, משמש לעתים קרובות 29 . המשוואה המיושמת כאן לוקחת בחשבון את פני השטח של הגוף ומשקל הגוף, ונמצאת בשימוש נפוץ ברפואה הסינית המסורתית.

סוגים רבים של בעלי חיים, כגון ארנבות, חזירי ים, חולדות, ועכברים, ניתן לבחור להכנת סרום המכיל סרום. מינים זהה לזו של תאים במבחנה במינון עדיף. במחקר זה, חולדות נבחרו כי הם מספקים יותר בסרום מאשר עכברים לעשות והם קרובים יותר לעכברים במונחים של מינים לעומת בעלי חיים אחרים. בנוסף, מומלץ להשתמש במינון במינון חוץ גופי ב vivo או במרפאה. הדילוליון של סרום (1:10 מומלץ) לא נלקח בחשבון; כלומר, פי 10 של המינון המקביל אינו מוחל על בעלי החיים שסופקו בסרום עקב התגובה הרעילה הפוטנציאלית הנגרמת על ידי תאים או איברים מטופלים 31 . תדירות ניהול התרופה משתנה פעם ביום למשך 3 עד 14 ימים עד פעמיים ביום (2 שעות בין כל מנהלה) 7 , 8 , 32 . זמן האיסוף מתרחש בדרך כלל בין השעות 1 ו -2 (לפני שעה 6) לאחר הממשל האחרון 33 , 34 . המטרה היא לשמור על ריכוז התרופה בדם יציב יחסית וברמת השיא שלו כאשר הדגימות נאספות 35 . השגרה הניהולית יכולה לכלול הזרקה, ניהול עור, או שאיפה, בהתאם לשגרת הממשל ב- vivo .

אי-המכיל סרום עדיין שנוי במחלוקת. התומכים סבורים שנוכחותם של רכיבים פעילים רבים, כגון הורמונים, אנזימים, נוגדנים ומשלים בסרום עצמו, עלולה לגרום לתגובות בלתי צפויות המשפיעות על התוצאות 36 . האופוזיציה סבורה כי המרכיבים הפעילים המיוצרים על ידי הסמים עשויים גם להיות מוסרים על ידי תהליך אי-פעילות 37 . כדי לאזן את זה, אנשים מעצבים את קבוצת הביקורת כך בסרום של בעלי חיים מלוחים משמש.

יש כמה מגבלות לפרוטוקול. איכות התמצית לא מוערכת לפני תחילת vivo ו במבחנה חוץ גופית . שנית, אנטיביוטיקה משמשים במדיום התרבות, אשר עלול לגרום אינטראקציות של תרופות עשב ודורש בדיקה נוספת. שלישית, הזמן ספוג ומבשלים נקבעים על סמך הניסיון שנצבר מן הקליני בפועל ניסויים בבעלי חיים. תקופות נוספות של זמן ניתן לבחור ואו השוואה. פעמים ספוג ומבשלים יכול להיות שונה עבור נוסחאות צמחים שונים. נפח מרתח עבור בעלי חיים הממשל ניתן לשנות על פי המין ואת הגיל והמשקל של החיה. החיה שנבחרה להכנת סרום המכיל סרום עבור שגרות הממשל ניתן לשנות, כאמור לעיל.

יחדיו, פרוטוקול ותוצאות לספק דוגמה להכנת ויישום של תמצית צמחים ב vivo ובמחקרים חוץ גופית . במקרים שונים, חלק מהפרטים חייבים להיות מותאמים, כולל תקופות הטיפול, מינים וניהול שגרות, על בסיס מאפייני צמחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81573992). אנו מודים אמילי ק לו ו Kathleen DiNapoli לעזרה בעריכת השפה שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) 160922 EXD components
Filter paper GElifesciences 99-103-952 Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 In vivo study
Sprague Dawley rats Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 EXD-containing serum preparation
Syringe filter Millipore SLGP033RB 0.22 µm
gavage needles (10 ml) Shanghai BO Ge trade sales department 59104274 Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)  Fujian Gutian Pharma Co. Ltd H35020148 Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg) Sunway Pharma Co. Ltd CB07591 Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium Gibco 12800-116 DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin Sigma 1277 100 µg / ml
Penicillin Sigma 4687 100 µg / ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
  2. Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
  3. Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
  4. Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
  5. Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
  6. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
  7. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
  8. Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
  9. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
  10. Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
  11. Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
  12. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  13. Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
  14. Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
  15. Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
  16. Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
  17. Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
  18. Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
  19. Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
  20. Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
  21. Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
  22. Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
  23. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  24. Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
  25. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  26. Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
  27. Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
  28. Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
  29. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  30. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  31. Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
  32. Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
  33. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  34. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  35. Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  36. Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  37. Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).

Tags

רפואה גיליון 123 er-xian מרתח סרום המכיל סרום pharmacology בסרום צמחי מרפא רפואה אינטגרטיבית רפואה סינית מסורתית,
הכנה של צמחי מרפא: Er-Xian מרתח ו Er-Xian המכיל בסרום עבור<em&gt; בויבו</em&gt;<em&gt; במבחנה</em&gt; ניסויים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J.,… More

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55654, doi:10.3791/55654 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter