Summary
Här presenterar vi förberedelsen av ett er-xian-avkok (EXD) i fyra steg, blötläggning, avkok, filtrering och koncentration - och demonstrera administrering av ett preparerat EXD-innehållande serum till råttor. Dessa metoder är tillämpliga på in vivo och in vitro- studier av växtbaserade dekoktioner, såsom traditionella kinesiska läkemedel.
Abstract
Traditionell örtmedicin, ett alternativt läkemedel i klinisk miljö, har fått ökad uppmärksamhet de senaste åren. Före leverans till kroppen krävs en extra extraktionsprocedur för att frigöra de aktiva beståndsdelarna från råa örter. Vattendekok är ett klassiskt extraktionsförfarande som fortfarande används i stor utsträckning i de kliniska inställningarna. Här föreslår vi ett detaljerat protokoll för er-xian-avkok (EXD) för att applicera växtbaserade dekoktioner till experimentella studier. Beräkningen av en djuranpassad dos beskrivs, liksom de fyra huvudstegen i EXD: blötläggning, vattendekoktion, filtrering och koncentration. Dessutom introduceras seruminnehållande EXD till råttor som ett medel för in vitro validering. Här administrerades råttor EXD under tre dagar. Blodprover uppsamlades sedan, inaktiverades, centrifugerades och filtrerades. Serumet, utspätt med odlingsmediet, kan användas för att behandla celler eller vävnader i vItro. Exempelvis applicerades EXD på både in vivo och in vitro studier och visade att EXD förbättrar osteogenes. Detta protokoll kan användas som referens för beredning och användning av växtbaserade läkemedel.
Introduction
Intresset för studier och tillämpning av traditionell växtbaserad medicin växer för närvarande. I motsats till moderna läkemedel, där kemiska ingredienser är bestämda, har örtformler vissa okända ingredienser och kräver extraktionsprocesser för att möjliggöra leverans av deras aktiva föreningar. Även om många studier försöker välja en liten förening med en välkänd struktur som representant för hela ört- eller örtformeln, kan varken farmakologiska effekter eller mekanismer betraktas som ekvivalenta 1 , 2 . Medan fingeravtryck gör det möjligt att analysera beståndsdelarna i komplexa örtformler analyseras vissa beståndsdelar fortfarande inte tydligt, vilket leder till en utmaning när man kombinerar alla extrakt för studie 3 . Samspelet mellan många beståndsdelar / extrakt förmedlar de terapeutiska effekterna av växtbaserade läkemedel. För att behålla denna fördel, den traditionella extrakt form-decoctJon-används fortfarande ofta i kliniken. Eftersom extraktförfarandet har stor inverkan på den terapeutiska effekten är ett standardprotokoll av traditionellt vattenavkok nödvändigt, särskilt för in vivo- studierna 4 , 5 .
Å andra sidan, när man undersöker farmakologiska mekanismer, är administreringen av växtbaserade dekoktioner under in vitro eller ex vivo studier också en utmaning. Konceptet av ett läkemedelsinnehållande serum föreslogs först av Tashino 1988 5 . Sedan dess har ökande antal forskare tillämpat det på växtbaserade läkemedel 7 , 8 , 9 . Även om metoden för läkemedelsinnehållande serum har vissa begränsningar, såsom påverkan av vissa komponenter i serumet, anses det fortfarande vara en metod som nära efterliknar fysiologiska förhållanden.
10 , 11 , 12 , 13 . Det har också applicerats på behandling av aplastisk anemi 14 , menopausal osteoporos 15 , 16 , 17 , för tidigt ovariefel 18 , bröstcancer 19 , ovariecancer 20 och fördröjd pubertet 21 . Här presenterar vi detaljerade protokoll för beredning av både er-xian-avkoket (EXD) och dess läkemedelsinnehållande serum. Dessutom beskriver vi tillämpningen av EXD och EXD-innehållande serum till murina menopausala osteoporotiska modeller.
En EXD består av 9 g av Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis och Radix Angelicae Sinensis och 6 g av Cortex Phellodendri och Rhizoma Anemarrhenae per vuxen patient per dag. Den ekvivalenta dosen för en mus är 0,1418 EXD / kg / dag baserat på följande ekvation 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA och dB avser dosen per kroppsvikt (mg / kg) hos människa respektive mus. Dosen i mg / kg ersätts med antalet EXD / kg. RA och RB representerar den mänskliga kroppsfaktorn respektive muskroppsfaktorn som är proportionella mot kroppsytan (m 2 ) / kroppsvikt (kg)) 2/3 (se tabell 1 ). WA och WB indikerar kroppsvikt (kg) av människa respektive mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna för djurvård vid Shanghai University of Traditional Chinese Medicine och godkänns av djurförsöket Shanghai Animal Ethics Committee.
1. Protokoll I: Framställning av EXD
- Beräkning
- Administrera EXD till en behandlingsgrupp av 10 sex månader gamla kvinnliga Impressing Control Region (ICR) möss (0,02 kg / mus), 5 dagar per vecka i 12 veckor.
OBS! Totalt behövs 1 702 EXD. Eftersom EXD-värden mäts i diskreta steg, i verklig praxis, administrera 2 EXDs. - Beräkna volymen EXD applicerad per mus ( dvs V = (0.1418 EXD / kg • dag) * (0,02 kg / mus) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / mus • dag).
- Administrera EXD till en behandlingsgrupp av 10 sex månader gamla kvinnliga Impressing Control Region (ICR) möss (0,02 kg / mus), 5 dagar per vecka i 12 veckor.
- blöt~~POS=TRUNC
- Lägg alla råvaror av två EXD ( dvs. Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) och Rhizoma Anemarrhenae (12 g), totalt 96 g) i en behållare med lock.
OBSERVERA: En keramisk behållare rekommenderas. - Mera de råa örterna med 500 ml destillerat vatten i 1 h; Vattnet ska täcka örterna med ungefär en tum. Låt alla örter noggrant suga.
- Lägg alla råvaror av två EXD ( dvs. Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) och Rhizoma Anemarrhenae (12 g), totalt 96 g) i en behållare med lock.
- Första vattenavkärningen
- Värm örterna med hjälp av en gaspanna eller en induktionskokare med hög effekt tills vattnet kokar (ca 5 - 10 min, tidsperioden beror på värmeffekten, behållaren och mängden örter och vatten). Slå av strömmen till en låg simmer i 2 timmar.
- Första filtreringen
- Täck en 500 ml glasbägare med vanligt filterpapper eller med gasväv och bomull. Häll försiktigt av avkoket i bägaren genom filtret. Lämna örterna i behållaren.
- Återvänd resterande örtrester oN filterpapperet till behållaren.
- Andra vattendekoktion
- Tillsätt destillerat vatten i behållaren med örterna; Låt det täcka örterna med ungefär en tum.
- Upprepa steg 1.3.
- Andra filtrering
- Upprepa steg 1.4.1 och 1.4.2.
- Häll av den andra avkoket i samma bägare. Blanda första och andra decoctions tillsammans.
- Koncentration
- Sätt bägaren på en gaspanna med asbestfri trådgas mellan dem, värm avkokningen med en låg simmer och rör långsamt och kontinuerligt med en glasstång.
- När avkokningen minskar till 200 ml, överför den till en 500 ml bägare.
- Upprepa steg 1.7.1 tills avkodningen minskar till 100 ml.
- Förvaring och administrering
- Överför det koncentrerade avkoket till en steril glasflaska. Låt det svalna till rumstemperaturenRe (RT). Förvara vid 4 ° C om det används inom en vecka eller vid -70 ° C för långvarig förvaring.
- Använd en sondnål, administrera 0,14 ml / mus av avkoket till ovariektomiserade (OVX) möss en gång per dag, 5 dagar i veckan i 12 veckor.
2. Protokoll II: Framställning av EXD-innehållande serum
- Beräkning
- Beräkna råttekvivalent dos (Röd) med 0,15 kg som kroppsvikt för varje råtta (1 månad gammal): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
OBS: Totalt 10 ml EXD-innehållande serum behövs för att framställa 100 ml odlingsmedium (10% EXD-innehållande serum). Varje råtta förväntas ge 2 ml serum. Sålunda behövs 6 råttor (en 20% förlust) för EXD administrering en gång om dagen i 3 dagar. Antalet EXD är: (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / råtta) * (6 råttor) * (3 dagar) = 0.300 EXD. Återigen, eftersom EXD-värden mäts i diskreta steg,Använd 1 EXD. - Beräkna volymen EXD applicerad per råtta ( dvs. V = (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / råtta) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / råtta • dag).
- Beräkna råttekvivalent dos (Röd) med 0,15 kg som kroppsvikt för varje råtta (1 månad gammal): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
- blöt~~POS=TRUNC
- Lägg råvarorna för 1 EXD i en behållare med lock. Mera de råa örterna i destillerat vatten i 1 h; Vattnet ska täcka örterna med ungefär en tum. Låt alla örter noggrant suga.
- Första vattenavkärningen
- Värm örterna med hjälp av en induktionskokare med hög effekt tills vattnet kokar (ca 5 - 10 min, tidsperioden beror på värmeffekten, behållaren och mängden örter och vatten). Slå på strömmen till en låg simmer i 2 timmar.
- Första filtreringen
- Täck en 500 ml glasbägare med vanligt filterpapper eller med gasväv och bomull. Häll försiktigt av avkoket i bägaren genom filtret. Lämna örterna i behållaren.
- Andra vattendekoktion
- Tillsätt destillerat vatten i behållaren med örterna; Låt det täcka örterna med ungefär en tum.
- Upprepa steg 2.4.
- Andra filtrering
- Upprepa steg 2.5.1 och 2.5.2.
- Häll av den andra avkoket i samma bägare som i steg 2.4.1 och blanda den första och den andra avkodningen tillsammans.
- Koncentration
- Sätt bägaren på en gaspanna med asbestfri trådgas mellan dem, värm avkokningen med en låg simmer och rör långsamt och kontinuerligt med en glasstång.
- När avkokningen minskar till 100 ml, överför den till en 100 ml bägare.
- Upprepa steg 2.7.1 tills avkodningen minskar till 50 ml.
- Förvaring och administrering
- Överför det koncentrerade dekokset till en stjärnaIle glasflaska. Låt det svalna till RT. Förvara vid 4 ° C om det används inom en vecka eller vid -70 ° C för långvarig förvaring.
- Administrera intraagastriskt 0,83 ml / råtta en gång per dag i 3 dagar.
- EXD-innehållande serumpreparat
- Bedöda råttorna genom intraperitonealt injektion av 300 ml / 100 g 80 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin vid 1 h efter den sista administreringen av EXD. Bekräfta korrekt bedövning med tånklämning.
- Inse skinnets och buken hos råttan från buken till botten av bröstkorgen med hjälp av en skalpell (eller rak saks). Skapa ett snitt av längd och djup på ca 5 cm respektive 0,5 cm. Flytta bukhinnan till vänster med vävnadspapper.
- Använd vävnadspapper, ta bort bindväven i buken aorta för att tydligt utsätta kärlet.
- Rita blodet långsamt från buken aorta med en 10 ml, 22 gauge spruta. Överför den tillEtt 15 ml sterilt rör efter avlägsnande av nålen; En råtta kan producera 8-10 ml blod.
OBS: Råttan borde vara levande ( dvs med buken aorta pulserande) när man börjar blodritningen och död efter att ritningen är färdig. - Klota blodet i upprätt läge i 30 - 60 minuter vid rum RT. Centrifugera vid 500-600 xg under 20 min. Placera försiktigt all supernatanten (serum) i ett 50 ml sterilt rör och blanda allt serum (från olika djur) tillsammans.
- Utför värmeinaktivering genom att inkubera serumet i ett 56 ° C vattenbad under 30 minuter. Filtrera serumet med ett sprutfilter med ett 0,22 μm porstorlek, hydrofilt polyeter-sulfonmembran. Använd serumet friskt eller förvara det vid -20 ° C.
- Kontroll av läkemedelsinnehållande serumpreparat (används i kontrollgruppen)
- Administrera varje råtta med samma volym saltlösning (0,83 ml) en gång per dag i 3 dagar. De övriga stegen är desamma som i steg 2.9.
- Ansökan
- Tillsätt 10 ml EXD-innehållande serum eller läkemedelsinnehållande serum till varje 100 ml medium plus 1% penicillin-streptomycin (PS) 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av EXD på bentätheten hos OVX-möss
Hematoxylin och eosin (H & E) färgning av ländryggsektionen visar ökad bentrabekula efter EXD-behandling in vivo ( Figur 1A , höger panel) jämfört med de i OVX-gruppen ( Figur 1A , vänster panel). Figur 1B visar de representativa μCT-bilderna av den 4 : e ländryggen i OVX-möss ( Figur 1B , vänster panel) och OVX-möss med EXD-behandling under 12 veckor ( Figur 1B , höger panel). Fler trabekulära ben ses i ländryggen hos EXD-behandlade möss än de hos OVX-möss med kontroll. Data från μCT-avbildningen indikerar en ökad benvolym / vävnadsvolym (BV / TV), trabekulärt tal (Tb. N) och trabekulär tjocklek (Tb. Th) och minskat trabekulärt avstånd (Tb Sp) hos den 4 : e ländryggen I EXD möss ( figur 1C ).
Effekten av EXD på osteogenesen av ben mesenkymala stamceller (bMSCs) från OVX möss
Figur 2 representerar den osteogena potentialen av bMSCs. Fettdroppar (asterisk, oregelbunden form av en lipiddroppe) bildas automatiskt när bMSCs av OVX-möss odlas i 7 dagar ( Figur 2A , vänster panel). I EXD-behandlade möss bildas bennoduler (pil) i stället för en fettdroppe ( Figur 2B , höger panel). En alkalisk fosfatasanalys (ALP) visar att mer ALP-positiva celler (lila) kan detekteras i EXD-behandlade bMSCs ( Figur 2B , höger panel) jämfört med de i bMSC från kontroll OVX-möss ( Figur 2B , vänster panel).
Förändringarna i genuttryck mellan OVX och EXD mösss = "xref"> 24
Hierarkisk clustering visar att uttrycket av 389 gener uppenbarat av mikroarray i bMSCs vika ändrats (> 1,5, normaliserat av icke-OVX-möss) mellan OVX och EXD-behandlade möss in vivo (totalt: 26 991 gener) ( Figur 3 ). Grön indikerar att uttrycket uppregulerades, medan rött indikerar att uttrycket var nedreglerat. Tre prover i samma grupp kluster samman först, vilket indikerar profilens tillförlitliga egenskaper. Figur 4 visar den överlappade signalvägen inriktad av EXD, både in vivo och in vitro .
Figur 1: Effekten av EXD på benmorfologi.
( A ) H & E-färgning av ländryggen 4 : a delen av OVX- och EXD-behandlade möss. (
Figur 2: Effekten av EXD på bMSC Differentiering.
( A ) Bilder av bMSCs odlade i 7 dagar efter beiNg isolerad från lårbenet hos OVX- eller EXD-behandlade möss. * Indikerar en fet droppe. En pil indikerar en bennodul. ( B ) ALP-färgning av OVX- och EXD-behandlade bMSCs odlade i 7 dagar (lila representerar ALP-positivt). ( C ) Kvantificering av ( B ). Kolumnerna representerar medelvärdet ± SE från tre rätter (sex möss) per grupp. ** p <0,01 EXD mot OVX (Studentens t-test). ( AC ) har modifierats från Shufen Liu et al. 24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av EXD på genuttrycksprofilen.
Värmekarta för den hierarkiska klustringen av uttryck av 389 gener i OVX och EXD bMSCs Skördas den 7 : e dagen efter disassociationen. Skalan (liten bild) indikerar vikförändringar normaliserade av icke-OVX bMSCs. Listan över gener finns i kompletterande fil 1 . Figuren har modifierats från Shufen Liu et al. 24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekten av EXD på överlappad signalväg i både in vivo och in vitro- experiment.
De första 10 överlappade signalvägarna som reverseras av EXD in vivo och EXD-innehållande serum in vitro baserat på KEGG-vägen. Generna relaterade till vägarna visas i kompletterande fil 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Arter | Mus | Råtta | marsvin | Kanin | Katt | Apa | Hund | Mänsklig |
| R | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
Tabell 1: R-faktor i olika arter.
R-faktorn i 8 arter som vanligen används vid farmakologisk forskning. R-faktorn är proportionell mot: (kroppsytans yta (m 2 ) / bVikt (kg)) 2/3 .
Kompletterande fil 1.
Information om 389 gener som är uppreglerade eller nedreglerade ≥1,5 gånger men räddas av EXD in vivo . Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2.
Information om signaleringsvägen (baserat på KEGG-vägen) och besläktade gener i både in vivo och in vitro- experiment. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under senare år har mer uppmärksamhet ägnats åt växtbaserade läkemedel, en typ av alternativ medicin som har tillämpats i kliniska miljöer i östvärlden i tusentals år. Olika från "bänk till säng" -mönster av modern medicin kräver traditionell örtmedicin först "bänk till bänk" för att förklara deras mekanismer. Detta kan följas av validering utförd vid bänktalet och bearbetning för utveckling av nyoptimerade droger. Hittills finns det flera utvinningsmetoder som har rapporterats till aktiva komponenter som släpps ut från hela formler eller örter. Bland dem är vattenutvinning den mest använda.
Vattenutvinningen av växtbaserade läkemedel har fyra grundläggande steg. Det första steget är blötläggning. En komplex örtmedicin makereras i vatten under en tidsperiod, vanligtvis från 0,5 till 1 h. Tidsperioden för blötläggning beror på kvantiteten och egenskapen hos de råa örterna. TillSe till att de råa örterna är noggrant blötläggda, mitt i varje stycke eller block ska vara brant. Vattenvolymen beror på den totala mängden örter. Ibland används växten av örterna för att bestämma hur mycket vatten som behövs för blötläggning. Ödets densiteter varierar emellertid mycket. Eftersom syftet med blötläggning är att macerera alla örter, vilket underlättar frisättningen av de aktiva komponenterna under de följande stegen, är volymen av örter föredragen för användning som referensstandard för vattenvolymen. Det andra steget är matlagning. Koknings- och simmeringsprocesserna har utvecklats under tusentals år. Variationen i tillagningstiden beror mest på typen av örter på grund av deras olika fysikaliska, kemiska och farmakologiska egenskaper 12 . Diaphoretik rekommenderas att laga mat under en kort tidsperiod, vanligtvis mindre än 20 minuter, medan aromater bör tillsättas bara några minuter före den första kokningen för att undvika flyktiga reaktioner. FEller tonic örter, krävs en lång tidsperiod för att läcka ut sina terapeutiska beståndsdelar. I detta fall används EXD för behandling av postmenopausal osteoporos under årtionden 12 . I traditionell kinesisk medicinteori anses detta syndrom vara orsakat av en njurrelaterad brist. EXD är huvudsakligen utformad för att tonifiera njurarna. Därför kokades EXD i 2 - 3 h för att tillåta EXD att utöva sina anti-osteoporotiska effekter 15 . Det tredje steget är filtrering. Filtrering bidrar till att förhindra att fodernålen blockeras med växtbaserade granuler. Det fjärde steget är koncentration. Volymen av sondadministrering bör noggrant övervägas. Det har rapporterats att stora volymer, såsom 10 ml / kg eller mer, administrerad genom oral gavage kan resultera i flera problem relaterade till absorption, inklusive snabb skakning av föreningarna till duodenum eller aspirationspneumoni associerad med passiv återflöde av materiaJag går in i matstrupen 25 . Således var volymerna som valts för möss och råttor omkring 7,5 ml / kg respektive 5,5 ml / kg.
Det är viktigt att bekräfta huruvida de effektiva beståndsdelarna av digererad och metaboliserad EXD i blodet liknar de hos det råa extraktet. När det gäller EXD bioekvivalens, Wu et al. Rapporterade bestämningen av 7 komponenter i hundplasma: epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin, sagittatosid B, 2 "-O-rhamnosyl-icarisid II och baohuosid I 26 . Hu et al. Hittade 21 föreningar i råttaplasma efter oral administrering 27 . Hittills har det råa extraktet från EXD inte rapporterats. Några av de effektiva komponenter som testats i blod, såsom icariin och berberin, har dock direkt applicerats på djur för jämförande observation 28 .
Det finns flera sätt att beräkna djuret bioeKvivalenta dosen. Den traditionella metoden baserad på kroppsvikt (mg / kg) är inte lämplig eftersom farmakokinetiken varierar i olika arter. Beräkningen baserad på kroppsytan (mg / m 2 ), där metabolismen är relaterad till den enskilda djurstorleken, används ofta 29 . Ekvationen som appliceras här tar hänsyn till både kroppsytans yta och kroppsvikt och används vanligtvis i traditionell kinesisk medicin 30 .
Många typer av djur, såsom kaniner, marsvin, råttor och möss, kan väljas för läkemedelsinnehållande serumpreparat. Samma art som för de in vitro- behandlade cellerna är föredragen. I denna studie valdes råttor eftersom de ger mer serum än mus gör och är närmare möss när det gäller arter jämfört med andra djur. Dessutom rekommenderas dosekvivalenten vid in vivo eller klinisk användning, vilket in vitro- protokollet visade. UtspädningenJon av serum (1:10 rekommenderas) beaktas inte; Det vill säga 10-faldig av ekvivalent dos appliceras inte på de serumtillhandahållna djuren på grund av den potentiella toxiska reaktionen orsakad av behandlade celler eller organ 31 . Läkemedelsadministrationsfrekvensen varierar från en gång om dagen i 3 till 14 dagar till två gånger per dag (2 timmar mellan varje administrering) 7 , 8 , 32 . Samlingstiden uppträder vanligen mellan timmar 1 och 2 (före timme 6) efter den sista administrationen 33 , 34 . Syftet är att hålla läkemedelskoncentrationen i blodet relativt stabil och på högsta nivå när proven samlas 35 . Administreringsrutinerna kan innefatta injektion, hudadministration eller inhalation, i enlighet med administrationsrutinerna in vivo .
Inaktiveringen av läkemedels-Innehållande serum är fortfarande kontroversiellt. Supporters tycker att närvaron av många aktiva komponenter, såsom hormoner, enzymer, antikroppar och komplement i själva serumet, kan leda till oväntade reaktioner som påverkar resultaten 36 . Oppositionen anser att de aktiva komponenterna som produceras av läkemedlen också kan avlägsnas genom inaktiveringsprocessen 37 . För att balansera detta utformar människor kontrollgruppen så att serumet från saltlösningsbehandlade djur används.
Det finns vissa begränsningar för protokollet. Kvaliteten på extraktet utvärderas inte innan man påbörjar in vivo och in vitro- experiment. För det andra används antibiotika i odlingsmediet, vilket kan orsaka interaktioner mellan örter och läkemedel och kräver ytterligare testning. För det tredje bestäms blötläggning och simmeringstid baserat på erfarenheterna från klinisk praxis och djurförsök. Fler tidsperioder kan väljas fEller jämförelse. Soaking och simmer gånger kan modifieras för olika örtformler. Avkokvolymen för djuradministration kan modifieras enligt arten och djurets ålder och vikt. Djuret som valts för framställning av läkemedelsinnehållande serum och för administreringsrutinerna kan ändras, såsom diskuterats ovan.
Tillsammans ger protokollet och resultaten ett exempel på beredning och applicering av växtdekok i in vivo och in vitro studier. I olika fall måste vissa detaljer optimeras, inklusive behandlingsperioder, arter och administrationsrutiner, baserade på växtegenskaperna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81573992). Vi tackar Emily K. Lo och Kathleen DiNapoli för deras språkredigeringshjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
- Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
- Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
- Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
- Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
- Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
- Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
- Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
- Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
- Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
- Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
- Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
- Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
- Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
- Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
- Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
- Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
- Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
- Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
- Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
