Summary
Aquí, se presenta la preparación de una decocción er-xian (EXD) en cuatro pasos-empapamiento, decocción, filtración y concentración- y demuestran la administración de un suero preparado para EXD a ratas. Estos métodos son aplicables al estudio in vivo e in vitro de las decocciones a base de hierbas como las medicinas tradicionales chinas.
Abstract
La medicina herbal tradicional, una medicina alternativa en el ambiente clínico, ha recibido una atención creciente en los últimos años. Antes de la entrega al cuerpo, se requiere comúnmente un procedimiento de extracción adicional para liberar los componentes activos de las hierbas crudas. La decocción acuosa es un procedimiento de extracción clásico que todavía se utiliza ampliamente en los entornos clínicos. Aquí, proponemos un protocolo detallado para la decocción er-xian (EXD) con el fin de aplicar las decocciones a base de hierbas a los estudios experimentales. Se describe el cálculo de una dosis apropiada para animales, así como los cuatro pasos principales de EXD: remojo, decocción de agua, filtración y concentración. Además, el suero que contiene EXD se introduce a las ratas como un medio de validación in vitro . En este caso, las ratas fueron administradas por vía oral EXD durante tres días. Las muestras de sangre se recogieron entonces, se inactivaron, se centrifugaron y se filtraron. El suero, diluido con el medio de cultivo, puede utilizarse para tratar células o tejidos en vItro Por ejemplo, EXD se aplicó tanto a estudios in vivo e in vitro y demostró que EXD mejora la osteogénesis. Este protocolo puede utilizarse como referencia para la preparación y aplicación de medicamentos herbales.
Introduction
El interés en el estudio y la aplicación de la medicina herbaria tradicional está creciendo actualmente. A diferencia de las drogas modernas, en las cuales los ingredientes químicos son definidos, las fórmulas herbarias tienen algunos ingredientes desconocidos y requieren procesos de extracción para permitir la entrega de sus compuestos activos. Aunque muchos estudios tratan de seleccionar un pequeño compuesto con una estructura bien conocida como representante de toda la hierba o fórmula herbaria, ni las eficacias farmacológicas ni los mecanismos pueden considerarse equivalentes 1 , 2 . Mientras que las huellas dactilares permiten el análisis de los constituyentes de fórmulas herbarias complejas, algunos constituyentes todavía no se analizan claramente, lo que conduce a un desafío cuando se combinan todos los extractos para el estudio 3 . Las interacciones de numerosos constituyentes / extractos median los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales. Para conservar esta ventaja, la forma tradicional de extracto-decocciónIon-todavía es ampliamente utilizado en la clínica. Dado que el procedimiento de extracción tiene un gran impacto en la eficacia terapéutica, es necesario un protocolo estándar de decocción tradicional de agua, especialmente para estudios in vivo 4 , 5 .
Por otro lado, al explorar mecanismos farmacológicos, la administración de decocciones a base de hierbas durante estudios in vitro o ex vivo es también un desafío. El concepto de un suero que contenía fármacos fue propuesto por primera vez por Tashino en 1988 6 . Desde entonces, un número creciente de investigadores lo han aplicado a la medicina herbal 7 , 8 , 9 . Aunque el método del suero que contiene fármaco tiene algunas limitaciones, tales como la influencia de ciertos componentes del suero, todavía se considera que es un método que imita de cerca las condiciones fisiológicas.
10 , 11 , 12 , 13 . También se ha aplicado al tratamiento de la anemia aplásica 14 , osteoporosis menopáusica 15 , 16 , 17 , fallo ovárico prematuro 18 , cáncer de mama 19 , cáncer de ovario 20 y pubertad tardía 21 . Aquí presentamos protocolos detallados para la preparación de la decocción er-xian (EXD) y su suero que contiene fármaco. Además, se describe la aplicación de EXD y EXD conteniendo suero a los modelos de osteoporosis menopáusicas murinos.
Un EXD se compone de 9 g cada uno de Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis y Radix Angelicae Sinensis y 6 g de Cortex Phellodendri y Rhizoma Anemarrhenae por paciente adulto al día. La dosis equivalente para un ratón es de 0,1418 EXD / kg / día basándose en la siguiente ecuación 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA y dB se refieren a la dosis por peso corporal (mg / kg) del ser humano y del ratón, respectivamente. La dosis, en mg / kg, se sustituye por el número de EXD / kg. RA y RB representan el factor del cuerpo humano y el factor corporal del ratón respectivamente, que son proporcionales a la (superficie corporal (m 2 ) / peso corporal (kg)) 2/3 (ver Tabla 1 ). WA y WB indican el peso corporal (kg) del humano y del ratón, respectivamente.
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Protocol
El protocolo sigue las pautas del cuidado animal de la universidad de Shangai de la medicina china tradicional y es aprobado por el experimento animal Comité de Ética animal de Shangai.
1. Protocolo I: Preparación de EXD
- Cálculo
- Administrar el EXD a un grupo de tratamiento de 10 ratones hembra de seis meses de edad de Imprinting Control Region (ICR) (0,02 kg / ratón), 5 días a la semana durante 12 semanas.
NOTA: Se necesitan un total de 1.702 EXDs. Debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos, en la práctica real, administrar 2 EXDs. - Calcular el volumen de EXD aplicado por ratón ( es decir, V = (0,1418 EXD / kg • día) * (0,02 kg / ratón) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / ratón • día).
- Administrar el EXD a un grupo de tratamiento de 10 ratones hembra de seis meses de edad de Imprinting Control Region (ICR) (0,02 kg / ratón), 5 días a la semana durante 12 semanas.
- Remojo
- Colocar todas las materias primas de dos EXD ( es decir, Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) y Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g en total) en un recipiente con tapa.
NOTA: Se recomienda un recipiente de cerámica. - Macerar las hierbas crudas con 500 mL de agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
- Colocar todas las materias primas de dos EXD ( es decir, Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) y Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g en total) en un recipiente con tapa.
- Primera decocción acuosa
- Calentar las hierbas utilizando una cocina de gas o una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 minutos, el tiempo depende de la potencia de calefacción, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Baja la potencia a fuego lento durante 2 h.
- Primera filtración
- Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
- Devolver el residuo de hierbas restanteN el papel de filtro al recipiente.
- Segunda decocción acuosa
- Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
- Repita el paso 1.3.
- Segunda filtración
- Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2.
- Vierta la segunda decocción en el mismo vaso. Mezclar la primera y la segunda decocciones juntas.
- Concentración
- Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo cocción a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una barra de vidrio.
- Cuando la decocción se reduce a 200 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 500 ml.
- Repita el paso 1.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 100 mL.
- Almacenamiento y administración
- Transferir la decocción concentrada a una botella de vidrio estéril. Dejar enfriar a temperatura ambienteRe (RT). Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Usando una aguja de sonda, administre 0,14 mL / ratón de la decocción a ratones ovariectomizados (OVX) una vez al día, 5 días a la semana durante 12 semanas.
2. Protocolo II: Preparación de suero que contiene EXD
- Cálculo
- Calcular la dosis equivalente de rata (RED) usando 0,15 kg como el peso corporal de cada rata (1 mes de edad): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / Kg / día.
NOTA: Se necesita un total de 10 ml de suero que contenga EXD para preparar 100 ml de medio de cultivo (10% de suero que contenga EXD). Se espera que cada rata proporcione 2 ml de suero. Por lo tanto, 6 ratas (una pérdida del 20% se tienen en cuenta) son necesarios para la administración de EXD una vez al día durante 3 días. El número de EXD es: (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (6 ratas) * (3 días) = 0.300 EXD. De nuevo, debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos,Utilice 1 EXD. - Calcular el volumen de EXD aplicado por rata ( es decir, V = (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rata • día).
- Calcular la dosis equivalente de rata (RED) usando 0,15 kg como el peso corporal de cada rata (1 mes de edad): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / Kg / día.
- Remojo
- Ponga las materias primas para 1 EXD en un recipiente con una tapa. Macerar las hierbas crudas en agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
- Primera decocción acuosa
- Calentar las hierbas utilizando una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 min, el tiempo depende de la potencia calorífica, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Apague la alimentación a fuego lento durante 2 h.
- Primera filtración
- Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
- Segunda decocción acuosa
- Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
- Repita el paso 2.4.
- Segunda filtración
- Repita los pasos 2.5.1 y 2.5.2.
- Vierta la segunda decocción en el mismo vaso de precipitados que en el paso 2.4.1 y mezcle la primera y la segunda decocciones juntas.
- Concentración
- Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una varilla de vidrio.
- Cuando la decocción se reduce a 100 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 100 ml.
- Repita el paso 2.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 50 ml.
- Almacenamiento y administración
- Transferir la decocción concentrada en unaBotella de vidrio. Dejar enfriar a RT. Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Administrar intragástralmente 0,83 mL / rata una vez al día durante 3 días.
- Preparación de suero que contiene EXD
- Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de 300 ml / 100 g de 80 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina a 1 h después de la última administración de EXD. Confirme la adecuada anestesia por pellizco del dedo del pie.
- Inciso de la piel y el peritoneo de la rata desde el abdomen hasta el fondo del tórax con un bisturí (o tijeras de operación recta). Crear una incisión de longitud y profundidad de unos 5 cm y 0,5 cm, respectivamente. Mueva las vísceras abdominales a la izquierda utilizando papel de seda.
- Usando papel tisú, retire el tejido conectivo de la aorta abdominal para exponer claramente el vaso.
- Saque la sangre lentamente de la aorta abdominal usando una jeringa calibre 22 de 10 ml. Transferirlo aUn tubo estéril de 15 ml después de retirar la aguja; Una rata puede producir 8-10 ml de sangre.
NOTA: La rata debe estar viva ( es decir, con la aorta abdominal pulsando) al comenzar el dibujo de sangre y muerta después de que el dibujo se complete. - Coagular la sangre en posición vertical durante 30 - 60 min a la habitación RT. Centrifugar a 500-600 xg durante 20 min. Colocar cuidadosamente todo el sobrenadante (suero) en un tubo estéril de 50 ml y mezclar todo el suero (de diferentes animales).
- Realizar la inactivación por calor mediante la incubación del suero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 min. Filtrar el suero utilizando un filtro de jeringa con una membrana de polietersulfona hidrófila de 0,22 μm de tamaño de poro. Utilice el suero fresco o guárdelo a -20 ° C.
- La preparación de suero que contiene un fármaco de control (utilizada en el grupo de control)
- Administrar cada rata con el mismo volumen de solución salina (0,83 mL) una vez al día durante 3 días. Los otros pasos son los mismos que en el paso 2.9.
- Solicitud
- Añadir 10 ml de suero que contenga EXD o suero que contenga fármaco a cada 100 ml de medio, más 1% de penicilina-estreptomicina (PS) [ 23] .
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Representative Results
El efecto de EXD sobre la densidad ósea de ratones OVX
La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) de la sección de la vértebra lumbar muestra un aumento de las trabéculas óseas después del tratamiento EXD in vivo ( Figura 1A , panel derecho) en comparación con las del grupo OVX ( Figura 1A , panel izquierdo). La Figura 1B muestra las imágenes representativas de μCT de la 4ª columna lumbar en ratones OVX ( Figura 1B , panel izquierdo) y OVX con tratamiento EXD durante 12 semanas ( Figura 1B , panel derecho). Se observan más huesos trabeculares dentro de la vértebra lumbar de ratones tratados con EXD que los de ratones OVX de control. Los datos de la imagen de μCT indican un aumento del volumen óseo / volumen de tejido (BV / TV), el número trabecular (Tb.N) y el grosor trabecular (Tb.Th) y la disminución del espaciamiento trabecular (Tb. Sp) de la 4ª columna lumbar En ratones EXD ( Figura 1C ).
El efecto de EXD sobre la osteogénesis de células madre mesenquimales óseas (bMSCs) de ratones OVX
La Figura 2 representa el potencial osteogénico de las BMSC. Las gotitas de grasa (asterisco, forma irregular de una gota de lípido) se forman automáticamente cuando se cultivan bMSCs de ratones OVX durante 7 días ( Figura 2A , panel izquierdo). En los ratones tratados con EXD, se forman nódulos óseos (flecha) en lugar de una gotita de grasa ( Figura 2B , panel derecho). Un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) demuestra que se pueden detectar más células positivas a ALP (púrpura) en las bMSC tratadas con EXD ( Figura 2B , panel de la derecha) en comparación con las de las bMSC de los ratones OVX control ( Figura 2B , panel izquierdo).
Los cambios en la expresión génica entre los ratones OVX y EXDS = "xref"> 24
Hierarchical agrupación muestra que la expresión de 389 genes revelados por microarray en bMSCs fue cambiado (> 1,5, normalizado por no OVX ratones) entre OVX y EXD-ratones tratados in vivo (total: 26.991 genes) ( Figura 3 ]. Verde indica que la expresión fue upregulated, mientras que el rojo indica que la expresión fue downregulated. Tres muestras en el mismo grupo se agrupan primero, indicando las cualidades confiables del perfil. La Figura 4 muestra la ruta de señalización superpuesta dirigida por EXD, tanto in vivo como in vitro .
Figura 1: El efecto de EXD en la morfología ósea.
( A ) Tinción de H & E de la 4ª sección lumbar de ratones tratados con OVX y EXD. Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org
Figura 2: El efecto de EXD en la diferenciación bMSC.
( A ) Las imágenes de bMSCs cultivadas durante 7 días después de beiNg aislado del fémur de ratones tratados con OVX o EXD. * Indica una gota de grasa. Una flecha indica un nódulo óseo. ( B ) tinción con ALP de BMSCs tratadas con OVX y EXD cultivadas durante 7 días (púrpura representa ALP positivo). ( C ) Cuantificación de ( B ). Las columnas representan la media ± SE de tres platos (seis ratones) por grupo. ** p <0,01 EXD versus OVX (prueba t de Student). ( AC ) se han modificado de Shufen Liu et al. 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El efecto de EXD en el perfil de expresión génica.
Calormap de la agrupación jerárquica de la expresión de 389 genes en OVX y EXD bMSCs Cosecha el 7º día después de la disociación. La escala (imagen pequeña) indica cambios de veces normalizados por bMSC no-OVX. La lista de genes se proporciona en el archivo suplementario 1 . La figura se ha modificado de Shufen Liu et al. 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efecto de la EXD en la vía de señalización superpuesta tanto en experimentos in vivo como in vitro .
Las primeras 10 vías de señalización superpuestas que se invierten por EXD in vivo y EXD que contiene suero in vitro basado en la vía KEGG. Los genes relacionados con las vías se muestran en el archivo suplementario 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies | Ratón | Rata | conejillo de indias | Conejo | Gato | Mono | Perro | Humano |
| R | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
Tabla 1: Factor R en diferentes especies.
El factor R en 8 especies que se utilizan comúnmente en la investigación farmacológica. El factor R es proporcional a: (superficie corporal (m 2 ) / b(Kg)) 2/3 .
Archivo suplementario 1.
Información sobre 389 genes que son upregulated o downregulated ≥ 1,5 veces, pero son rescatados por EXD in vivo . Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 2.
Información sobre la vía de señalización (basada en la vía KEGG) y genes relacionados tanto en experimentos in vivo como in vitro . Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En los últimos años, se ha prestado más atención a las hierbas medicinales, un tipo de medicina alternativa que se ha aplicado en el entorno clínico en el mundo oriental durante miles de años. Diferente del patrón de "banco a la cama" de la medicina moderna, la medicina herbal tradicional primero requiere la "cama al banco" patrón para explicar sus mecanismos. Esto puede ser seguido por la validación realizada en la etapa de banca y el procesamiento para el desarrollo de fármacos recién optimizados. Hasta ahora, hay varios métodos de extracción que se han informado a la liberación de componentes activos de fórmulas enteras o hierbas. Entre ellos, la extracción de agua es la más ampliamente utilizada.
La extracción de agua de hierbas medicinales tiene cuatro pasos básicos. El primer paso es remojar. Una medicina herbaria compleja es macerada en agua por un período de tiempo, generalmente de 0.5 a 1 h. El lapso de tiempo para el remojo depende de la cantidad y propiedad de las hierbas crudas. AAsegúrese de que las hierbas crudas están completamente empapadas, el centro de cada pieza o bloque debe ser empapado. El volumen de agua depende del volumen total de hierbas. A veces, el peso de las hierbas se utiliza para determinar cuánta agua se necesita para el remojo. Sin embargo, las densidades de hierba varían ampliamente. Dado que el propósito del remojo es macerar todas las hierbas, facilitando la liberación de los componentes activos durante las etapas siguientes, se prefiere el volumen de hierbas para su uso como patrón de referencia para el volumen de agua. El segundo paso es cocinar. Los procesos de hervir y hervir a fuego lento se han desarrollado durante miles de años. La variación en el tiempo de cocción depende principalmente del tipo de hierbas, debido a sus diferentes características físicas, químicas y farmacológicas 12 . Se sugiere que los diaforéticos se cocinen durante un corto período de tiempo, usualmente menos de 20 minutos, mientras que los aromáticos deben añadirse sólo unos minutos antes de la primera ebullición para evitar reacciones volátiles. FO hierbas tónicas, se requiere un largo período de tiempo para lixiviar sus componentes terapéuticos. En este caso, EXD se utiliza para el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica durante décadas 12 . En la teoría de la medicina tradicional china, este síndrome se considera causado por una deficiencia relacionada con el riñón. EXD está diseñado principalmente para tonificar el riñón. Por lo tanto, el EXD se cocinó durante 2 - 3 h para permitir que el EXD a ejercer sus efectos anti-osteoporóticos [ 15] . El tercer paso es la filtración. La filtración ayuda a evitar que la aguja de sonda se obstruya con los gránulos de hierbas. El cuarto paso es la concentración. El volumen de administración de gavage debe ser considerado cuidadosamente. Se ha informado que grandes volúmenes, tales como 10 ml / kg o más, administrados por sonda oral pueden dar lugar a varios problemas relacionados con la absorción, incluyendo la derivación rápida de los compuestos al duodeno o neumonía por aspiración asociada con el reflujo pasivo del MateriaL en el esófago 25 . Por lo tanto, los volúmenes escogidos para ratones y ratas eran alrededor de 7,5 ml / kg y 5,5 ml / kg, respectivamente.
Es importante confirmar si los componentes efectivos de EXD digerido y metabolizado en la sangre son similares a los del extracto crudo. En términos de bioequivalencia de EXD, Wu et al. Informaron la determinación de 7 componentes en el plasma del perro: epimedina A, epimedina B, epimedina C, icariina, sagittatosida B, 2 "-O-ramnosil icarisida II y baohuósido I26. Hu et al. Encontraron 21 compuestos en plasma de rata después de la administración oral 27 . Hasta ahora, el extracto crudo de EXD no ha sido reportado. Sin embargo, algunos de los componentes eficaces probados en la sangre, como icariin y berberina, se han aplicado directamente a los animales para la observación comparativa [ 28] .
Hay múltiples enfoques para calcular la bioe animalDosis equivalente. El método tradicional basado en el peso corporal (mg / kg) no es apropiado debido a que la farmacocinética varía en diferentes especies. El cálculo basado en la superficie corporal (mg / m 2 ), en el que la tasa metabólica está relacionada con el tamaño individual del animal, se utiliza con frecuencia 29 . La ecuación aplicada aquí tiene en cuenta la superficie corporal y el peso corporal y se utiliza comúnmente en la medicina tradicional china 30 .
Pueden elegirse muchos tipos de animales, tales como conejos, cobayas, ratas y ratones, para la preparación de suero que contiene fármaco. Se prefiere la misma especie que la de las células tratadas in vitro . En este estudio, las ratas fueron elegidas porque proporcionan más suero que los ratones y están más cerca de los ratones en términos de especies en comparación con otros animales. Además, se recomienda la dosis equivalente en el uso in vivo o clínico, como lo demostró el protocolo in vitro . El dilutIon de suero (se recomienda 1:10) no se tiene en cuenta; Es decir, 10 veces la dosis equivalente no se aplica a los animales proporcionados por el suero debido a la posible reacción tóxica causada por células u órganos tratados [ 31] . La frecuencia de administración del fármaco varía de una vez al día durante 3 a 14 días a dos veces al día (2 h entre cada administración) 7 , 8 , 32 . El tiempo de recolección generalmente ocurre entre las horas 1 y 2 (antes de la hora 6) después de la última administración 33 , 34 . El objetivo es mantener la concentración de fármaco en la sangre relativamente estable y en su nivel máximo cuando se recogen las muestras 35 . Las rutinas de administración pueden incluir inyección, administración de la piel o inhalación, de acuerdo con las rutinas de administración in vivo .
La inactivación del fármaco-Que contiene suero sigue siendo controvertido. Los partidarios piensan que la presencia de muchos componentes activos, tales como hormonas, enzimas, anticuerpos y complementos en el propio suero, puede resultar en reacciones inesperadas que afectan los resultados 36 . La oposición cree que los componentes activos producidos por los fármacos también podrían eliminarse por el proceso de inactivación 37 . Para equilibrar esto, las personas diseñan el grupo de control de tal manera que el suero de los animales tratados con solución salina se utiliza.
Hay algunas limitaciones al protocolo. La calidad del extracto no se evalúa antes de iniciar la experimentación in vivo e in vitro . En segundo lugar, los antibióticos se utilizan en el medio de cultivo, que puede causar interacciones hierba-drogas y requiere más pruebas. En tercer lugar, el tiempo de remojo y cocción a fuego lento se determina en base a la experiencia obtenida de la práctica clínica y la experimentación con animales. Se pueden elegir más períodos de tiempo fO comparación. Los tiempos de remojo y cocción a fuego lento se pueden modificar para diferentes fórmulas a base de hierbas. El volumen de decocción para la administración de animales puede modificarse de acuerdo con la especie y la edad y peso del animal. El animal elegido para la preparación del suero que contiene fármaco y para las rutinas de administración puede ser cambiado, como se ha discutido anteriormente.
En conjunto, el protocolo y los resultados proporcionan un ejemplo para la preparación y aplicación de la decocción a base de hierbas en estudios in vivo e in vitro . En diferentes casos, algunos de los detalles deben ser optimizados, incluyendo los períodos de tratamiento, las especies y las rutinas de administración, en base a las características de las hierbas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81573992). Damos las gracias a Emily K. Lo y Kathleen DiNapoli por su ayuda en la edición de idiomas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
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