Summary
Hier presenteren we de voorbereiding van een er-xian decoctie (EXD) in vier stappen: ontdooiing, afkooksel, filtratie en concentratie- en de toediening van een bereid EXD-bevattende serum aan ratten aan te tonen. Deze methoden zijn van toepassing op de in vivo en in vitro studie van kruiddekkingen zoals traditionele Chinese geneesmiddelen.
Abstract
Traditionele kruidengeneeskunde, een alternatief geneesmiddel in de klinische omgeving, heeft de afgelopen jaren meer aandacht gekregen. Voordat u naar het lichaam overgaat, is er een extra extractieprocedure nodig om de actieve bestanddelen van ruwe kruiden te laten vrijkomen. Waterafkooksel is een klassieke extractie procedure die nog steeds in grote mate gebruikt wordt in de klinische instellingen. Hier voorstellen we een gedetailleerd protocol voor er-xian decoction (EXD) om kruidendecten toe te passen op experimentele studies. De berekening van een dierlijke dosis wordt beschreven, evenals de vier hoofdtrappen van EXD: doordrenken, waterafkooksel, filtratie en concentratie. Daarnaast wordt serum-bevattende EXD geïntroduceerd voor ratten als middel voor in vitro validatie. Hier waren ratten gedurende 3 dagen oraal toegediend met EXD. Bloedmonsters werden vervolgens verzameld, geïnactiveerd, gecentrifugeerd en gefiltreerd. Het serum, verdund met het kweekmedium, kan worden gebruikt om cellen of weefsels te behandelen in vItro. Zo werd bijvoorbeeld EXD toegepast op zowel in vivo als in vitro studies en bleek dat EXD osteogenese verbetert. Dit protocol kan gebruikt worden als referentie voor de bereiding en toepassing van kruidengeneesmiddelen.
Introduction
De interesse in de studie en toepassing van traditionele kruiden geneeskunde groeit momenteel. In tegenstelling tot moderne medicijnen, waarin chemische ingrediënten zijn bepaald, bevatten kruidenformules sommige onbekende ingrediënten en worden extractieprocessen vereist om de afgifte van hun actieve verbindingen mogelijk te maken. Hoewel veel studies proberen een kleine verbinding te selecteren met een bekende structuur als representatief voor de gehele kruiden- of kruidenformule, kunnen de farmacologische efficiënties noch mechanismen als equivalent 1 , 2 worden beschouwd. Terwijl vingerafdrukken de analyse van de bestanddelen van complexe kruidenformules mogelijk maken, zijn sommige bestanddelen nog niet duidelijk geanalyseerd, wat leidt tot een uitdaging bij het combineren van alle extracten voor studie 3 . De interacties van talrijke bestanddelen / extracten bemiddelen de therapeutische effecten van kruidengeneesmiddelen. Om dit voordeel te behouden, wordt de traditionele extractvorm-decoctIon-wordt nog steeds veel gebruikt in de kliniek. Aangezien de extractieprocedure een grote invloed heeft op de therapeutische werkzaamheid, is een standaard protocol van traditionele waterafkok noodzakelijk, vooral voor in vivo studies 4 , 5 .
Aan de andere kant, bij het onderzoeken van farmacologische mechanismen, is de toediening van kruiddekkingen tijdens in vitro of ex vivo studies ook een uitdaging. Het concept van een geneesmiddel bevattend serum werd voor het eerst in 1988 door Tashino voorgesteld 6 . Sindsdien heeft toenemend aantal onderzoekers het toegepast op kruidengeneeskunde 7 , 8 , 9 . Hoewel de methode van geneesmiddel bevattend serum enkele beperkingen heeft, zoals de invloed van bepaalde componenten van het serum, wordt het nog steeds beschouwd als een methode die de fysiologische omstandigheden nauwlettend nabootst.
10 , 11 , 12 , 13 te verlichten. Het is ook toegepast op de behandeling van aplastische anemie 14 , menopauzale osteoporose 15 , 16 , 17 , vroegtijdige ovariale mislukking 18 , borstkanker 19 , eierstokkanker 20 en vertraagde puberteit 21 . Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor de bereiding van zowel de er-xian decoction (EXD) en het geneesmiddel bevattende serum. Daarnaast beschrijven we de toepassing van EXD- en EXD-bevattende serum op muizen-menopauzale osteoporotische modellen.
Een EXD bestaat uit 9 g elk van Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis en Radix Angelicae Sinensis en 6 g elk van Cortex Phellodendri en Rhizoma Anemarrhenae per volwassen patiënt per dag. De equivalente dosis voor een muis is 0,1418 EXD / kg / dag op basis van de volgende vergelijking 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA en dB verwijzen naar de dosis per lichaamsgewicht (mg / kg) van respectievelijk de mens en muis. De dosis, in mg / kg, wordt vervangen door het aantal EXD / kg. RA en RB vertegenwoordigen respectievelijk de respectievelijke menselijke lichaamsfactor en muislichaamfactor, die evenredig zijn aan het lichaamsoppervlak (m 2 ) / lichaamsgewicht (kg)) 2/3 (zie tabel 1 ). WA en WB geven het lichaamsgewicht (kg) van de mens en muis aan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen voor dierenwelzijn van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine en is goedgekeurd door het dierproefbedrijf Shanghai Animal Ethics Committee.
1. Protocol I: Bereiding van EXD
- Berekening
- Beheer de EXD aan een behandelingsgroep van 10 zes maanden oude vrouwelijke Impressive Control Region (ICR) muizen (0,02 kg / muis), 5 dagen per week gedurende 12 weken.
OPMERKING: er zijn in totaal 1.702 EXD's nodig. Omdat EXD's in discrete stappen worden gemeten, in de praktijk, 2 EXD's toedienen. - Bereken het volume van de toegediende EXD per muis ( dwz V = (0.1418 EXD / kg • dag) * (0,02 kg / muis) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / muis • dag).
- Beheer de EXD aan een behandelingsgroep van 10 zes maanden oude vrouwelijke Impressive Control Region (ICR) muizen (0,02 kg / muis), 5 dagen per week gedurende 12 weken.
- soaking
- Zet alle grondstoffen van twee EXD's ( dwz Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) en Rhizoma Anemarrhenae (12 g), in totaal 96 g) in een houder met een deksel.
OPMERKING: een keramische container wordt aanbevolen. - Meng de ruwe kruiden met 500 ml gedestilleerd water gedurende 1 uur; Het water moet de kruiden ongeveer een centimeter bedekken. Laat alle kruiden grondig doordrenken.
- Zet alle grondstoffen van twee EXD's ( dwz Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) en Rhizoma Anemarrhenae (12 g), in totaal 96 g) in een houder met een deksel.
- Eerste waterafkooksel
- Verhit de kruiden met een gasfornuis of een inductie kookplaat op hoog vermogen tot het water kookt (ongeveer 5 - 10 minuten; de tijdsduur hangt af van de verwarmingsvermogen, de container en de hoeveelheid kruiden en water). Zet de stroom voor 2 uur aan een lage sudder.
- Eerste filtratie
- Dek een glasbeker van 500 ml met regelmatig filterpapier of met gaas en katoen. Giet de afkoeling zorgvuldig door de filter in de beker. Laat de kruiden in de container.
- Breng de resterende kruidenresten terugN het filterpapier naar de container.
- Tweede waterafkooksel
- Voeg gedestilleerd water toe aan de container met de kruiden; Laat het de kruiden ongeveer een centimeter bedekken.
- Herhaal stap 1.3.
- Tweede filtratie
- Herhaal stappen 1.4.1 en 1.4.2.
- Giet de tweede afkooksel in dezelfde beker af. Meng de eerste en tweede deco's samen.
- Concentratie
- Zet de beker op een gasfornuis met asbestvrij draad gaas tussen hen, verhit de afkooksel met behulp van een lage sudder, en langzaam en continu roeren met een glazen staaf.
- Wanneer de decodering tot 200 ml vermindert, overstappen naar een 500 ml beker.
- Herhaal stap 1.7.1 tot de decodering tot 100 ml vermindert.
- Opslag en toediening
- Breng de geconcentreerde afkoeling over op een steriele glazen fles. Laat het afkoelen tot kamertemperatuurRe (RT). Bewaar bij 4 ° C als u binnen een week of bij -70 ° C gebruikt voor langdurige opslag.
- Met behulp van een zaagnaald, moet u gedurende 12 weken 0,14 ml / muis van de afkooksel aan ovariectomized (OVX) muizen één keer per dag, 5 dagen per week, toedienen.
2. Protocol II: Bereiding van EXD-bevattende serum
- Berekening
- Bereken de rat-equivalent dosis (RED) met behulp van 0,15 kg als het lichaamsgewicht van elke rat (1 maand oud): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
OPMERKING: Er zijn 10 ml EXD-bevattende serum nodig om 100 ml kweekmedium (10% EXD-bevattende serum) te bereiden. Er wordt verwacht dat elke rat 2 ml serum levert. Zo zijn 6 ratten (een verlies van 20% in aanmerking genomen) nodig voor EXD-toediening eenmaal per dag gedurende 3 dagen. Het aantal EXD's is: (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rat) * (6 ratten) * (3 dagen) = 0.300 EXD. Nogmaals, omdat EXD's in discrete stappen gemeten worden,Gebruik 1 EXD. - Bereken het volume van de toegediende EXD per rat ( dat wil zeggen V = (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rat) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / rat • dag).
- Bereken de rat-equivalent dosis (RED) met behulp van 0,15 kg als het lichaamsgewicht van elke rat (1 maand oud): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
- soaking
- Leg de grondstoffen voor 1 EXD in een container met een deksel. Meng de ruwe kruiden in gedistilleerd water gedurende 1 uur; Het water moet de kruiden ongeveer een centimeter bedekken. Laat alle kruiden grondig doordrenken.
- Eerste waterafkooksel
- Verhit de kruiden met behulp van een inductie kookplaat op hoog vermogen tot het water kookt (ongeveer 5 - 10 minuten; de tijdsduur hangt af van de warmtekracht, de container en de hoeveelheid kruiden en water). Zet de stroom voor 2 uur aan een lage sudder.
- Eerste filtratie
- Dek een glasbeker van 500 ml met regelmatig filterpapier of met gaas en katoen. Giet de afkoeling zorgvuldig door de filter in de beker. Laat de kruiden in de container.
- Tweede waterafkooksel
- Voeg gedestilleerd water toe aan de container met de kruiden; Laat het de kruiden ongeveer een centimeter bedekken.
- Herhaal stap 2.4.
- Tweede filtratie
- Herhaal stappen 2.5.1 en 2.5.2.
- Giet de tweede afkooksel in dezelfde beker als in stap 2.4.1 en meng de eerste en tweede deco's samen.
- Concentratie
- Zet de beker op een gasfornuis met asbestvrij draad gaas tussen hen, verwarm de afkoeling met een lage sudder, en langzaam en continu roeren met een glazen staaf.
- Wanneer de decodering tot 100 ml vermindert, overstappen naar een 100 ml beker.
- Herhaal stap 2.7.1 tot de decoctie tot 50 ml vermindert.
- Opslag en toediening
- Breng de geconcentreerde afkoeling in een sterIle glazen fles. Laat het afkoelen naar RT. Bewaar bij 4 ° C als u binnen een week of bij -70 ° C gebruikt voor langdurige opslag.
- Intragastrisch toedienen gedurende 3 dagen 0,83 ml / rat een keer per dag.
- EXD-bevattende serumbereiding
- Verdoof de ratten door intraperitoneale injectie van 300 ml / 100 g 80 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine bij 1 uur na de laatste toediening van EXD. Bevestig de juiste verdoving door de nekknijp.
- Verhelder de huid en het buikholte van de rat van de buik naar de onderkant van de thorax met behulp van een scalpel (of een rechtstreekse werkschaar). Maak een snede van lengte en diepte van respectievelijk 5 cm en 0,5 cm. Verplaats de buikviscera naar links met behulp van tissuepapier.
- Verwijder het bindweefsel van de abdominale aorta met behulp van weefselpapier om het vat duidelijk te openbaren.
- Trek het bloed langzaam uit de abdominale aorta met een 10 ml, 22 gauge spuit. Verplaats het naarEen 15 ml steriele buis na het verwijderen van de naald; Een rat kan 8-10 ml bloed produceren.
OPMERKING: De rat moet levend zijn ( dwz met de buikspier aorta) wanneer de bloedtekening begint en dood is nadat de tekening is voltooid. - Klop het bloed in de rechtopstand gedurende 30 - 60 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 500-600 xg gedurende 20 minuten. Plaats al het supernatant (serum) voorzichtig in een 50 ml steriele buis en meng al het serum (van verschillende dieren) samen.
- Voer warmte-inactivering uit door het serum gedurende 30 minuten in een 56 ° C waterbad te incuberen. Filter het serum met behulp van een spuitfilter met een hydrofiel polyethersulfonmembraan van 0,22 μm poriegrootte. Gebruik het serum vers of berg deze op -20 ° C.
- Controleer geneesmiddelbevattende serumbereiding (gebruikt in de controlegroep)
- Beheer elke rat met hetzelfde volume zoutoplossing (0,83 ml) eenmaal per dag gedurende 3 dagen. De andere stappen zijn hetzelfde als in stap 2.9.
- Toepassing
- Voeg 10 ml EXD-bevattende serum- of geneesmiddelhoudend serum toe aan elk 100 ml medium plus 1% penicilline-streptomycine (PS) 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het effect van EXD op de botdichtheid van OVX-muizen
Hematoxyline- en eosin- (H & E) -vervaging van de lumbale wervelkolom toont verhoogde bottrabeculae na EXD-behandeling in vivo ( Figuur 1A , rechter paneel) vergeleken met die in de OVX-groep ( Figuur 1A , linker paneel). Figuur 1B toont de representatieve μCT beelden van de 4e lumbale in OVX muizen ( Figuur 1B , linker paneel) en OVX muizen met EXD behandeling gedurende 12 weken ( Figuur 1B , rechter paneel). Meer trabekulaire botten worden gezien in de lumbale wervel van EXD-behandelde muizen dan die van de OVX-muizen van de controle. De gegevens van de μCT-beeldvorming wijzen op een verhoogd botvolume / weefselvolume (BV / TV), trabekulair getal (Tb. N) en trabeculaire dikte (Tb. Th) en verminderde trabeculaire afstand (Tb. Sp) van de 4e lumbale In EXD muizen ( figuur 1C ).
Het effect van EXD op de osteogenese van botmesenchymale stamcellen (bMSC's) van OVX-muizen
Figuur 2 vertegenwoordigt het osteogene potentieel van bMSCs. Vetdruppels (asterisk, onregelmatige vorm van een lipiedruppel) worden automatisch gevormd wanneer bMSCs van OVX-muizen gedurende 7 dagen worden gekweekt ( Figuur 2A , linker paneel). Bij EXD-behandelde muizen worden botknooppunten (pijl) gevormd in plaats van een dikke druppel ( Figuur 2B , rechter paneel). Een alkalische fosfatase (ALP) analyse toont aan dat meer ALP-positieve cellen (paars) kunnen worden gedetecteerd in EXD-behandelde bMSC's ( Figuur 2B , rechter paneel) vergeleken met die in bMSC's van controle OVX-muizen ( Figuur 2B , linker paneel).
De veranderingen in genuitdrukking tussen OVX en EXD muizens = "xref"> 24
Hiërarchische clustering laat zien dat de expressie van 389 genen die door microarray in bMSC's werd onthuld, werd veranderd (> 1,5, genormaliseerd door niet-OVX-muizen) tussen OVX en EXD-behandelde muizen in vivo (totaal: 26.991 genen) ( Figuur 3 ). Groen geeft aan dat de uitdrukking upregulated was, terwijl rood aangeeft dat de uitdrukking downregulated was. Drie monsters in dezelfde groep worden eerst geclusterd, waarbij de betrouwbare eigenschappen van het profiel worden aangegeven. Figuur 4 toont de overlappende signaalweg die door EXD is gericht, zowel in vivo als in vitro .
Figuur 1: Het effect van EXD op botmorfologie.
( A ) H & E-kleuring van de lumbale 4e sectie van OVX- en EXD-behandelde muizen. (
Figuur 2: Het effect van EXD op bMSC Differentiatie.
( A ) Beelden van bMSCs die 7 dagen na bei worden gekweektNg geïsoleerd uit de femur van OVX of EXD-behandelde muizen. * Geeft een dikke druppel aan. Een pijl geeft een botknoop aan. ( B ) ALP-kleuring van OVX- en EXD-behandelde bMSC's die 7 dagen worden gekweekt (paars vertegenwoordigt ALP-positief). ( C ) Kwantificering van ( B ). De kolommen vertegenwoordigen de middelen ± SE van drie gerechten (zes muizen) per groep. ** p <0,01 EXD versus OVX (Student's t-test). ( AC ) zijn gewijzigd van Shufen Liu et al. 24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Het effect van EXD op het genuitdrukkingsprofiel.
Heatmap van de hiërarchische clustering van expressie van 389 genen in OVX en EXD bMSCs Geoogst op de 7e dag na disassociatie. De schaal (klein beeld) geeft vouwveranderingen genormaliseerd door niet-OVX bMSCs. De lijst van genen staat in aanvullend bestand 1 . De figuur is gewijzigd van Shufen Liu et al. 24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 4: Het effect van EXD op overlappende signaalweg in zowel in vivo als in vitro- experimenten.
De eerste 10 overlappende signaalbanen die in vitro door EXD in vivo en EXD-bevattende serum worden omgekeerd, gebaseerd op de KEGG-route. De genen die verband houden met de trajecten worden weergegeven in aanvullend bestand 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Soorten | Muis | Rat | cavia | Konijn | Kat | Aap | Hond | menselijk |
| R | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
Tabel 1: R-factor in verschillende soorten.
De R-factor in 8 soorten die gewoonlijk worden gebruikt in farmacologisch onderzoek. De R-factor is evenredig aan: (lichaamsoppervlakte (m 2 ) / bOdy gewicht (kg)) 2/3 .
Aanvullend bestand 1.
Informatie over 389 genen die upregulated of downregulated ≥1,5-voudig zijn, maar worden gered door EXD in vivo . Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2.
Informatie over de signaalweg (gebaseerd op de KEGG-route) en gerelateerde genen in zowel in vivo als in vitro experimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren is meer aandacht besteed aan kruidengeneesmiddelen, een soort alternatief geneesmiddel dat al duizenden jaren in de klinische omgeving in de oostelijke wereld is toegepast. Afwijkend van het "bank-tot-bed" -patroon van het moderne medicijn, hebben traditionele kruidengeneeskunde eerst het 'bed-to-bench'-patroon nodig om hun mechanismen uit te leggen. Dit kan gevolgd worden door validatie uitgevoerd op de bank en verwerken voor de ontwikkeling van nieuw geoptimaliseerde drugs. Tot nu toe zijn er verscheidene extractiemethoden die zijn gemeld aan de vrijgave actieve componenten van hele formules of kruiden. Onder hen wordt waterwinning het meest gebruikt.
De waterwinning van kruidengeneesmiddelen heeft vier basisstappen. De eerste stap is doordrenken. Een complex kruidengeneeskunde wordt gedurende een periode in water gemerkt, meestal van 0,5 tot 1 uur. De tijdsduur voor het doordrenken hangt af van de hoeveelheid en het eigendom van de ruwe kruiden. TotZorg ervoor dat de ruwe kruiden grondig doordrenkt zijn, het middelpunt van elk stuk of blok moet doordrenkt worden. Het volume water hangt af van het totale volume kruiden. Soms wordt het gewicht van de kruiden gebruikt om te bepalen hoeveel water nodig is om te ontdoen. De dichtheid van de kruiden varieert echter sterk. Aangezien het doel van het doordrenken is om alle kruiden te macereren, waardoor de afgifte van de actieve componenten gedurende de volgende stappen wordt vergemakkelijkt, is het volume kruiden voor de voorkeur als referentie standaard voor het volume water. De tweede stap is koken. De koken en sudderen zijn al duizenden jaren ontwikkeld. De variatie in de kooktijd hangt meestal af van het soort kruiden, vanwege hun verschillende fysische, chemische en farmacologische eigenschappen 12 . Diaphoretica wordt voorgesteld om te koken voor een korte periode, meestal minder dan 20 minuten, terwijl aromaten slechts enkele minuten moeten worden toegevoegd voordat de eerste kook wordt om vluchtige reacties te vermijden. FOf tonic kruiden, is een lange tijd nodig om hun therapeutische bestanddelen uit te legen. In dit geval wordt EXD gebruikt voor de behandeling van postmenopauzale osteoporose gedurende decennia 12 . In de traditionele Chinese geneeskunde theorie wordt dit syndroom geacht te zijn veroorzaakt door een nier-gerelateerde tekort. EXD is voornamelijk ontworpen om de nier te toneren. Daarom werd de EXD gekookt gedurende 2 - 3 uur om de EXD in staat te stellen zijn anti-osteoporotische effecten 15 uit te oefenen. De derde stap is filtratie. Filtrering helpt om te voorkomen dat de zaagnaald verstopt raakt met de kruidengranen. De vierde stap is concentratie. Het volume van de toediening moet zorgvuldig worden overwogen. Er is gemeld dat grote hoeveelheden, zoals 10 ml / kg of meer, toegediend door orale sonde, kunnen resulteren in verscheidene problemen met betrekking tot absorptie, met inbegrip van de snelle afschakeling van de verbindingen naar de duodenum of aspiratiepneumonie geassocieerd met de passieve reflux van de materiaIk ga naar de slokdarm 25 . Zo waren de volumes die voor de muizen en ratten werden gekozen, respectievelijk ongeveer 7,5 ml / kg en 5,5 ml / kg.
Het is belangrijk om te bevestigen of de effectieve componenten van verteerd en gemetaboliseerd EXD in het bloed vergelijkbaar zijn met die van het ruwe extract. Wat betreft EXD bioequivalentie, Wu et al. Gerapporteerde de bepaling van 7 componenten in hondeplasma: epimedine A, epimedine B, epimedine C, icariine, sagittatoside B, 2 "-O-rhamnosyl icariside II en baohuoside I 26 . Hu et al. Gevonden 21 verbindingen in rat plasma na orale toediening 27 . Tot nu toe is het rauwe extract van EXD niet gemeld. Sommige effectieve componenten die in bloed zijn getest, zoals icariine en berberine, zijn echter direct toegepast op dieren voor vergelijkende observatie 28 .
Er zijn meerdere benaderingen om het dier bioe te berekenenQuivalente dosis. De traditionele methode op basis van lichaamsgewicht (mg / kg) is niet geschikt omdat de farmacokinetiek varieert in verschillende soorten. De berekening op basis van het lichaamsoppervlak (mg / m 2 ), waarbij de stofwisselingssnelheid verband houdt met de individuele dierengrootte, wordt vaak gebruikt 29 . De hier toegepaste vergelijking houdt rekening met zowel lichaamsoppervlakte als lichaamsgewicht en wordt algemeen gebruikt in traditionele Chinese geneeskunde 30 .
Veel soorten dieren, zoals konijnen, cavia's, ratten en muizen, kunnen gekozen worden voor geneesmiddelbevattende serumbereiding. Dezelfde soort als die van de in vitro behandelde cellen heeft de voorkeur. In deze studie werden ratten gekozen omdat ze meer serum leveren dan muizen doen en dichter bij muizen zijn in termen van soorten in vergelijking met andere dieren. Bovendien wordt de dosisquivalent in in vivo of klinisch gebruik aanbevolen, zoals het in vitro protocol toonde. Het verdunnenIonen van serum (1:10 wordt aanbevolen) wordt niet in aanmerking genomen; Dat wil zeggen, 10-voudig van de equivalente dosis wordt niet toegepast op de serum-verstrekte dieren als gevolg van de mogelijke toxische reactie veroorzaakt door behandelde cellen of organen 31 . De frequentie voor geneesmiddeladministratie varieert van een keer per dag gedurende 3 tot 14 dagen tot twee keer per dag (2 uur tussen elke toediening) 7 , 8 , 32 . De collectietijd gebeurt meestal tussen uren 1 en 2 (vóór uur 6) na de laatste toediening 33 , 34 . Het doel is de drugconcentratie in het bloed relatief stabiel en op het hoogste niveau te houden wanneer de monsters worden verzameld 35 . De toedieningsroutines kunnen injectie, huidadministratie of inhalatie omvatten, in overeenstemming met de in vivo toedieningsroutines.
De inactivatie van drug-Bevattende serum is nog steeds controversieel. Ondersteuners denken dat de aanwezigheid van veel actieve componenten, zoals hormonen, enzymen, antilichamen en supplementen in het serum zelf, kunnen leiden tot onverwachte reacties die de resultaten beïnvloeden 36 . De oppositie is van oordeel dat de actieve componenten die door de medicijnen worden geproduceerd, ook kunnen worden verwijderd door het inactivatieproces 37 . Om dit evenwicht te ontwerpen, ontwerpen mensen de controlegroep zodanig dat het serum van zoutbehandelde dieren wordt gebruikt.
Er zijn enkele beperkingen op het protocol. De kwaliteit van het extract wordt niet geëvalueerd alvorens in vivo en in vitro experimenten te starten. Ten tweede worden antibiotica gebruikt in het kweekmedium, wat kruid-drug interacties kan veroorzaken en verdere tests nodig hebben. In de derde plaats worden de doordringende en koken tijd bepaald op basis van de ervaring die wordt verkregen uit de klinische praktijk en dierproeven. Meer tijdsperioden kunnen gekozen worden fOf vergelijking. De soaking en sudderen kunnen aangepast worden voor verschillende kruidenformules. Het decoctievolume voor dierlijke toediening kan worden gewijzigd volgens de soort en de leeftijd en het gewicht van het dier. Het dier dat is gekozen voor de bereiding van geneesmiddel bevattend serum en voor de toedieningsroutines kan worden veranderd, zoals hierboven besproken.
Gecombineerd, het protocol en de resultaten geven een voorbeeld voor de bereiding en toepassing van kruidenafkok in in vivo en in vitro studies. In verschillende gevallen moeten sommige details worden geoptimaliseerd, waaronder de behandelingsperioden, soorten en toedieningsroutines, gebaseerd op de kruidenkenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81573992). We bedanken Emily K. Lo en Kathleen DiNapoli voor hun taalbewerkingshulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
- Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
- Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
- Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
- Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
- Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
- Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
- Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
- Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
- Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
- Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
- Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
- Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
- Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
- Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
- Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
- Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
- Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
- Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
- Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
