Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как<em> In Vitro</em> Инструмент скрининга в исследованиях слуха
Summary
Цель этого протокола – продемонстрировать подготовку, культуру, лечение и иммунизацию неонатальных мышечных эксплантов. Эта методика может быть использована в качестве инструмента для скрининга in vitro при исследовании слуха.
Abstract
Несмотря на то, что за последние несколько десятилетий были отмечены значительные успехи в проведении исследований в области слуха, до сих пор нет лечения от потери сенсорного слуха (SNHL), что обычно связано с повреждением или потерей чувствительных механосенсорных структур внутреннего уха. В последние годы появились сложные анализы in vitro и ex vivo , позволяющие скринировать все большее число потенциально терапевтических соединений, одновременно сводя к минимуму ресурсы и ускоряя усилия по разработке лечения SNHL. Хотя однородные культуры некоторых типов клеток продолжают играть важную роль в текущих исследованиях, многие ученые теперь полагаются на более сложные органотипические культуры внутренних ушей мыши, также известные как кохлеарные экспланты. Сохранение организованных ячеистых структур внутри внутреннего уха способствует оценке in situ различных компонентов инфраструктуры улитки, включая внутренние и внешние волосковые клетки, спиральные ганглиозные нейроны, нейронItes и поддерживающих ячеек. Здесь мы представляем препарат, культуру, лечение и иммуноокрашивание неонатальных эксплантов кохлеарных мышей. Тщательная подготовка этих эксплантов облегчает идентификацию механизмов, которые способствуют СНЛЛ, и представляет собой ценный инструмент для сообщества исследователей слуха.
Introduction
Sensorineural Hearing Loss (SNHL) отражает повреждение внутреннего уха или восходящего слухового пути. В то время как потеря слуха является наиболее распространенным сенсорным дефицитом у людей 1 , лечебная терапия еще не существует 2 . Хотя кохлеарные или слуховые имплантаты мозга могут восстановить некоторую степень слуха у пациентов с тяжелым глубоким СНЛ, слух, предоставляемый этими устройствами, по-прежнему сильно отличается от «естественного» слуха, особенно во время попыток понять речь в шуме или слушать музыку.
В то время как дегенерация волосяных клеток уже давно считается основным следствием травматических слуховых событий ( например, воздействие громкого шума), все больше доказательств того, что синапсы, передающие информацию от волосковых клеток к слуховому нерву, по меньшей мере так же уязвимы к акустической травме 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . Поскольку человеческие аудиометрические пороги, текущий золотой стандарт для оценки слуховой функции, не предсказывают специфическое повреждение клеток во внутреннем ухе, необходимы более совершенные инструменты, чтобы как можно скорее обнаружить клеточную дегенерацию и начать адекватное лечение. 7 .
Перспективные фармацевтические методы лечения потери слуха часто тестируются на гомогенных клеточных культурах in vitro , но такие системы не точно моделируют микросреды улитков. Известно, что кохлеарные клетки выделяют трофические факторы, которые влияют на другие типы клеток в улитке 8 , 9 , решающий процесс in vivo , который теряется, когда орган Corti 10 , 11 или спиральные ганглиозные нейроны (SGN) 12 культивируются изолированно или когда Анализируются молекулярные маркерыEf "> 13. Однако исследования in vivo, которые могут потребоваться для валидации данных in vitro для установления новых персонализированных методов лечения потери слуха в погоне за« прецизионной медициной », требуют значительных ресурсов и времени. Это особенно важно при рассмотрении Сколько усилий требуется для совершенствования и выполнения инъекций мембран среднего уха или круглого окна с помощью тестов на слух и последующего вскрытия кохлеарных целых креплений. Эффективный скрининг перспективных соединений в органотипических культурах ex vivo, известных как кохлеарные экспланты, обеспечивает экономическую и надежную альтернативу 14 , 15 , 16 , 17 .
В этой статье описывается протокол, позволяющий генерировать, поддерживать и оценивать обработанные кохлеарные экспланты. Подчеркиваются конкретные приложения для этой модели, в том числе ее использование в скринингеПотенциально терапевтических соединений и сравнительной оценки вирусных векторов для генной терапии. Эксвариантный подход ex vivo позволяет исследователям визуализировать эффекты данного лечения на разных популяциях клеток in situ , облегчая идентификацию механизмов типа клеток и последующее уточнение целевых терапевтических средств.
В целом, этот метод дает модель для изучения улитки ex vivo, сохраняя при этом жизненно важный перекрестный разговор между сильно различными типами клеток, которые сосуществуют внутри улитки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследователи должны совершенствовать метод вскрытия перед проведением экспериментов с использованием кохлеарных эксплантов. Волосяные клетки обычно повреждаются во время вскрытий, выполненных на ранней стадии обучения, и особенно проблематичным моментом для их целостности являе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других нарушений коммуникации грантами R01DC015824 (KMS) и T32DC00038 (поддержка SD), грантом Министерства обороны W81XWH-15-1-0472 (KMS), Фондом Бертарелли (KMS), Фонд Нэнси Сэйлса (KMS) и Исследовательский центр Lauer Tinnitus (KMS). Мы благодарим Джессику Э. Сэнгерс, Б.А. за проницательные комментарии к рукописи.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
