Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em> In vitro</em> İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı
Summary
Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Abstract
Son birkaç on yılda yapılan işitme araştırmalarında dikkate değer ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, tipik olarak iç kulaktaki hassas mekano-algılama yapılarına hasar veren veya kaybedilen bir durum olan Sensorineural İşitme Kaybı (SNHL) için herhangi bir tedavi yoktur. Son yıllarda sofistike in vitro ve ex vivo testler ortaya çıkmış ve kaynakları azaltmak ve SNHL için iyileştirme çabalarını hızlandırırken potansiyel olarak terapötik bileşiklerin sayısının artmasını mümkün kılmıştır. Bazı hücre türlerinin homojen kültürleri günümüz araştırmalarında önemli rol oynamaya devam etse de, birçok bilim adamı şimdi koklear eksplant olarak da bilinen daha kompleks organometalik faregiller arası kulak kültürlerine güveniyor. Organik hücresel yapıların iç kulak içinde korunması, iç ve dış kıl hücreleri, spiral ganglion nöronları, sinir hücreleriItes ve destekleyici hücreler. Burada neonatal farelerde koklear eksplantların hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanması sunulmuştur. Bu eksplantların dikkatli bir şekilde hazırlanması, SNHL'ye katkıda bulunan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve işitme araştırmaları topluluğu için değerli bir araç teşkil eder.
Introduction
Sensorinöral İşitme Kaybı (SNHL), iç kulakta veya artan işitme yolunda hasar olduğunu gösterir. İşitme kaybı, insanlardaki en yaygın duyusal eksiklik iken, küratif terapiler henüz mevcut değildir 2 . Koklear veya işitsel beyin sapı implantları ağır derecede derinlemesine SNHL olan hastalara bir dereceye kadar işitme becerisi kazandırabilmesine rağmen, özellikle de sesli konuşmayı anlamaya veya müzik dinlemeye çalışırken, bu cihazların sağladığı işitme "doğal" işitme durumundan çok farklıdır.
Saç hücresi dejenerasyonu, uzun süredir travmatik işitsel olayların ( örneğin, yüksek gürültüye maruz kalma) birincil sonuç olarak düşünülürken , bilginin saç hücrelerinden işitme sinirine iletildiği sinapsların en azından akustik travmaya karşı savunmasız olduğu yönünde artan bir kanıt vardır 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . İşitsel işlevi değerlendirmek için kullanılan altın standart olan insan odyometrik eşikleri, iç kulaktaki belirli hücresel hasarı öngörmemektedir, mümkün olduğunca çabuk hücresel dejenerasyonu saptamak ve uygun tedaviyi başlatmak için daha rafine edilmiş araçlar gerekmektedir.
İşitme kaybı için umut verici farmasötik tedaviler genellikle homojen hücre kültürleri üzerinde in vitro olarak denenir, ancak bu tür sistemler koklear mikro çevreyi doğru bir şekilde modellememektedir. Koklear hücrelerin Corti 10 , 11 ya da Spiral Ganglion Nöronları (SGNs) 12 organı izole edildiğinde ya da ne zaman ne de olsa, koklea 8 , 9 içindeki diğer hücre tiplerini etkileyen trofik faktörleri salgılarlar. Moleküler belirteçler analiz edilirEf "> 13. Bununla birlikte," hassas tıp "arayışında işitme kaybı için yeni ve kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak için in vitro verilerin geçerliliği için gerekli olabilecek in vivo çalışmalar önemli kaynaklara ve zamana ihtiyaç duymaktadır. Işitme testleri ve müteakip koklear tüm montajların diseksiyonu ile orta kulak veya yuvarlak pencere membran enjeksiyonlarını mükemmelleştirmek ve gerçekleştirmek için ne kadar çaba gerekir? Koklear eksplant olarak bilinen organotipik ex vivo kültürlerde umut verici bileşiklerin verimli taranması, ekonomik ve güvenilir bir alternatif sağlar 14 , 15 , 16 , 17 .
Bu makalede, tedavi edilen koklear eksplantların üretilmesi, sürdürülmesi ve değerlendirilmesi için kullanılan bir protokol açıklanmaktadır. Taramada kullanımı da dahil olmak üzere, bu model için özel uygulamalar vurgulanmaktadırPotansiyel olarak terapötik bileşikler ve gen terapisi için viral vektörlerin karşılaştırmalı değerlendirmesi. Bir ex vivo eksplant yaklaşımı, araştırmacıların belirli bir tedavinin etkilerini , in situ olarak farklı hücre popülasyonları üzerinde görselleştirmesini ve hücre tipine özgü mekanizmaların tanımlanmasını ve daha sonra hedeflenen terapötiklerin arıtılmasını kolaylaştırır.
Genel olarak, bu teknik, kokleada bir arada bulunan çok çeşitli hücre tipleri arasındaki yaşamsal çapraz konuşmayı korurken, kokleayı ex vivo çalışmak için bir model sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Araştırmacılar, koklear eksplantları içeren deneyleri yapmadan önce diseksiyon tekniğini mükemmelleştirmelidirler. Saç hücreleri, öğrenme eğrisinin başlarında gerçekleştirilen diseksiyonlar sırasında sıklıkla hasar görürler ve bütünlüğü için özellikle sorunlu bir an, sabit eller, uygun araçlar ve deneyim gerektiren, tectorial membranın çıkarılmasıdır. Zamandan ve kaynaklardan kazanmak için diseksiyon mikroskopu altında görsel bir kontrol yapılmalı ve potansiyel olarak hasar gö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) tarafından desteklenmiştir. Nancy Sayles Day Vakfı (KMS) ve Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS). Yazı hakkında anlayışlı yorumlar için BA'ya Jessica E. Sagers'e teşekkür ediyoruz.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
