Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em> In Vitro</em> Screening Tool in Hearing Research
Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera beredning, kultur, behandling och immunostaining av neonatala murina cochleära explanter. Tekniken kan användas som ett in vitro- screeningsverktyg vid hörselforskning.
Abstract
Även om det har förekommit märkliga framsteg när det gäller att höra forskning under de senaste decennierna, finns det fortfarande ingen bot för Sensorineural Hearing Loss (SNHL), ett tillstånd som vanligtvis innebär skada på eller förlust av de ömma mekanosensoriska strukturerna i det inre örat. Sofistikerade in vitro- och ex vivo- analyser har uppstått under de senaste åren, vilket möjliggjorde screening av ett ökande antal potentiellt terapeutiska föreningar samtidigt som resurserna minimeras och påskyndas för att utveckla botemedel för SNHL. Även om homogena kulturer av vissa celltyper fortsätter att spela en viktig roll i nuvarande forskning, bygger många forskare nu på mer komplexa organotypa kulturer av murinöron, även kända som cochleära explanter. Behållandet av organiska cellulära strukturer inom inre örat underlättar in situ utvärdering av olika komponenter i den cochleära infrastrukturen, inklusive inre och yttre hårceller, spiral ganglion neuroner, neurItes och stödande celler. Här presenterar vi beredning, odling, behandling och immunostaining av neonatala murina cochleära explanter. Den försiktiga förberedelsen av dessa explants underlättar identifieringen av mekanismer som bidrar till SNHL och utgör ett värdefullt verktyg för hörselforskningsgruppen.
Introduction
Sensorinär hörselnedsättning (SNHL) återspeglar skador på inre örat eller stigande hörselvägen. Medan hörselnedsättning är det vanligaste sensoriska underskottet hos människor 1 , finns inte läkande terapier 2 . Även om cochleära eller auditiva hjärnstammarimplantat kan återställa en viss grad av hörsel för patienter med svårt till djupt SNHL, är hörseln som tillhandahålls av dessa enheter fortfarande väldigt annorlunda än "naturlig" hörsel, särskilt under försök att förstå tal i ljud eller att lyssna på musik.
Medan hårcellsdegenerering länge har ansetts vara den primära följden av traumatiska hörselhändelser ( t.ex. exponering för högt brus) finns det växande bevis på att synapserna som överför information från hårceller till hörselnerven är åtminstone lika utsatta för akustisk trauma 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . Eftersom de mänskliga audiometriska tröskelvärdena, den nuvarande guldstandarden för utvärdering av hörselfunktionen, inte förutsäger specifik cellulär skada i inre örat behövs mer raffinerade verktyg för att detektera cellulär degenerering så snart som möjligt och att initiera adekvat behandling 7 .
Lovande farmaceutiska behandlingar för hörselnedsättning testas ofta på homogena cellkulturer in vitro , men sådana system modellerar inte exakt den cochleära mikromiljön. Cochleära celler är kända för att utsöndra trofiska faktorer som påverkar andra celltyper inom cochlea 8 , 9 , en avgörande in vivo- process som går förlorad när organ i Corti 10 , 11 eller Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 odlas isolerat eller när Molekylära markörer analyserasEf "> 13. In vivo- studier som kan vara nödvändiga för validering av in vitro- data för att skapa nya personliga behandlingar för hörselnedsättning i strävan efter" precisionsmedicin "kräver betydande resurser och tid. Detta är särskilt relevant när man överväger Hur mycket ansträngning krävs för att perfekta och utföra mellersta öra eller runda fönstermembraninjektioner med hörselprov och efterföljande dissektion av cochleära helmottagningar. Effektiv screening av lovande föreningar i organotypa ex vivo kulturer som kallas cochlear explants ger ett ekonomiskt och tillförlitligt alternativ 14 , 15 , 16 , 17 .
I denna artikel beskrivs ett protokoll för att generera, underhålla och utvärdera behandlade cochleära explanteringar. Specifika applikationer för denna modell betonas, inklusive dess användning vid screeningenAv potentiellt terapeutiska föreningar och den jämförande utvärderingen av virala vektorer för genterapi. En ex vivo explant-metod ger forskare möjlighet att visualisera effekterna av en given behandling på olika cellpopulationer in situ , underlätta identifieringen av celltypsspecifika mekanismer och efterföljande förfining av riktade terapeutiska medel.
Sammantaget ger denna teknik en modell för att studera cochlea ex vivo samtidigt som man behåller vitala samtal mellan de väldigt olika celltyperna som existerar i cochlea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskare måste perfekta dissektionstekniken innan de utför experiment som involverar cochleära explanter. Hårceller är vanligtvis skadade under dissektioner som utförs tidigt i inlärningskurvan, och ett särskilt problematiskt ögonblick för deras integritet är avlägsnandet av det tectoriella membranet, vilket kräver stabila händer, lämpliga verktyg och erfarenhet. För att spara tid och resurser bör en visuell kontroll utföras under dissektionsmikroskopet och eventuellt skadade områden bör noteras. I s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Deafness och andra kommunikationsstörningar som ger R01DC015824 (KMS) och T32DC00038 (stödja SD), försvarsministeriet W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) och Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Vi tackar Jessica E. Sagers, BA för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
